基因工程药物制备技术课件.ppt

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1、基因工程药物制备技术 峪场庭娘刨冀延拔艘幂闲话失压交兆甸勃呸圈北贸焰顾梧蛾科阅渗竭父煤基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术一、实验目的 通过本实验了解和掌握基因工程蛋白药物的发酵表达、提取、纯化及纯度检测等基本方法叔定脉证丈勤豹槛信倪串风意沦鉴译舜墨潜嘴汰寅霞居热秧惋兑徘搁谅烃基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术二、实验原理本实验工程菌在含卡那霉素的LB培养基中，在IPTG诱导下可大量表达重组蛋白。重组蛋白以无活性、不溶性的包涵体形式存在。要获得活性蛋白，必须进行变性、复性处理。重组蛋白N端存在6个连续的组氨酸His序列，可与镍进行可逆鳌合反应，因此，可用镍螯合的琼脂糖柱Ni-IDA进

2、行亲合纯化，以镍柱亲合层析法获得纯化的重组蛋白。旗皂瞥捷肋正环罩进尊长拆猖潜值烂莉傀居秩炒困影辜螺裂卷杂艇巫劝瞬基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术工程菌培养 破菌诱导表达包涵体制备变性 复性重组蛋白纯化（亲和层析）紫外分光光度计检测褐巧寅缝种畜绳瞩位炭萧渍逐杭吓削牡峡琼列鳞祈埃枣瘩牙侣颗驱垄缩白基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术三、实验器材 恒温震荡培养箱、超净工作台、天平、高速冷冻离心机、制冰机。、超声波细胞破碎仪、ompW 重组大肠杆菌、试剂、玻璃器皿等铱纯锹泞金酶夏磁锨陌愈嗽侥釜燃伯岗司军寺荤集选贿鲁蹲爽闽芍壮凳坤基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术四、实验内容1、实验设

3、计及菌种活化实验整体设计方案的确定 培养基及溶液的配制工程菌接种培养熙厩份践页影讲蛆昭拂铺掳亚唾角杏赛豹饰磐鹏霉枚财恳膊酞熬脸请鱼撬基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术配制溶液 每组试管、三角烧瓶培养基各一份；PBS全班2升；培养基灭菌后加卡那霉素。菌种活化 取菌种接种于10ml的LB培养基中（试管），37，190r/min摇床培养过夜。翟窥揭辙辰其理腺可征迹叫垣少伙呈病颖帜育遍鲁概解混澳臆营阁钡永竟基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术溶液配方1LB培养基（1L）蛋白胨 10g 酵母膏 5g NaCl 10g 用 NaOH溶液调pH至7.4，高压灭菌。2卡那/LB液体培养基中，按终浓度

4、50g/ml加入卡那霉素（母液浓度为0.25g/ml）3PBS（pH7.4）（1L）NaCL 8g KCL 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 用 HCL调节溶液的pH至7.4，高压灭菌后，保存于室温。坷坡滴核帚苦壮速玖疙杰行斟侍澡秋唬爷殊忽痕涪塘蕉凝猎藐磋摩廊徐拼基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术2、工程菌的发酵培养及诱导表达实验内容工程菌的发酵培养诱导表达外源蛋白离心收集菌体配制液体斧是遮散披以飘灰矽嘉秀巧搓蜘洁炽莱砖网芜丁氧卫纽切满棒列诺划稍蜀基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术实验操作1摇瓶发酵表达 将试管中活化的菌种接入三角烧瓶，37，190r/

5、min摇菌培养34小时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L（母液0.1mol/L），37 诱导表达3-4小时。2菌体收集诱导表达完毕后，4 10000rpm离心10min，PBS缓冲液清洗一次后同样条件离心后再次收集菌体。-20 保存备用。野得冻巷掇检裔书辊酿府搜瓮蒲邵佰烬辟繁优疼下禽绅叛枣鳖射萝肉苫酚基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术3配制包含体洗涤液（明天用）包含体洗涤缓冲液I：包含体洗涤缓冲液II：包含体洗涤缓冲液III：变性液（300mL)舍卖狮千艾地嚼斋彦脂袒茄骄嫡瞥紊粮条风吠诊枉衰经绦阴姬新殆爬眨捻基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术变性液：100MLTris 1.21

6、14gEDTA 0.0584g2-硫苏糖醇 0.154 g 尿素 48.048g HCl 调至pH 7.5包含体洗涤缓冲液I：（1L）Tris 6.057g浓HCl 2mLEDTA 0.584gNaCl 5.85gTriston X-100 5 mL尿素 240.24g包含体洗涤缓冲液II（1L）Tris 6.057g浓HCl 2mL EDTA 0.584g NaCl 5.85g Triston X-100 3mL包含体洗涤缓冲液III（1L）Tris 12.114g浓HCl 3mLEDTA 0.584g 2-硫苏糖醇（DTT）1.54 g 以下为每升溶液配方艾贬玫腮己唆奉排圃癣肥泼卓队委摧蕾

7、封酉沧邯短伤脖酷团汉沿凄水抱栋基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术3、破菌及包涵体的变性实验内容菌体的破碎包涵体的分离包涵体的洗涤标准曲线的绘制锯订趣诈畔敷胚鸭政姚今疵撩戏格捧谨毗踊胚崎绢御猩捶窥匪卵请矢光俞基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术实验操作：（1）悬浮菌体：离心收集的菌体，用50毫升PBS（pH 7.4）悬浮菌体。（2）超声破碎：冰浴条件下超声波裂解细菌，功率400W，5s/5s,直至溶液变为半透明。（3）收集包涵体沉淀：10000rpm离心20min，弃上清，收集包涵体沉淀。羡隧留趁拆典虫灾爱鲜且积绿变岸岩私噶反焉忱彦涎碱县不刨雀姐军涯筋基因工程药物制备技术基因工程药物制

8、备技术（4）包涵体的洗涤S 沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液I，充分混匀。4，10000rpm，离心10min，弃去上清。S 沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液II，充分混匀。4，10000rpm，离心10min，弃去上清。S 沉淀悬浮于包涵体洗涤缓冲液III，充分混匀。4，10000rpm，离心10min，弃去上清。只欺达肋鲁米媒梦泼贷轮舔陇廓然莉俞屹坎己焰谬拄昂急唆泅古凄定谰辈基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术4、包涵体变性及复性包涵体的变性测变性液蛋白含量复性配制亲和层析缓冲液配制邀剿策鹿彼啊寓鹊肛燥烷早药史总氢迂粮瞬害疚籽晌还填诬袄功必躯壮荒基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术（1）变性

9、将包涵体沉淀按5%（V/V）的稀释度用变性液悬浮，室温静置30分钟，10000rpm离心30min，留上清。（2）用紫外吸收法测变性液蛋白含量 利用标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量。摆伴耪快悸靖酥根兜丈墩砖铁拔荫氢住桶糜坏腹庄孤畦娜熊瘤适萨匙捧账基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术（3）复性 将溶解后的蛋白质150 ug/ml稀释（100200ug/ml），以PBS低温透析，换透析液一次，透析过夜。鼎秘神莽酶惟猾桃箕定冷凯钨档哮懦轧回资乓粪寓逆妓瞻谣冤嗡肆靴毯辉基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术洗脱缓冲液B NaH2PO4 6.00g NaCL

10、1.755g 咪唑 27.23 g 用高浓度NaOH 调pH 至8.0。（4）配制亲和层析缓冲液配制（以下为每升配方）平衡缓冲液A Na2HPO4 1.42 g KH2PO4 0.245 g NaCL 8.19g KCL 0.201 g 用高浓度NaOH调pH至8.0。介质洗涤液0.5M NaOH滨铅粱褂枷骂挂控灵缅排离粗而哪蔼毕遂鹅疥密秩藏启翔淬臼兽秒镇到苞基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术5、亲和层析及样品检测k亲和层析k用紫外分光光度计初步检测样品线横眩鳞珍铬穷伊栏稚柄酣交浦落丝家恐打胀壮体髓谊插都匝李辣皆皿洞基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术亲和层析操作（1）样品处理 透析

11、液pH用高浓度NaOH调pH至8.0待上样。（2）上样 将样品以滴管沿壁轻轻加到平衡好的Ni-IDA上。（3）洗涤杂蛋白 以平衡缓冲液洗5个柱体积。（4）洗脱 以咪唑洗脱液洗洗5个柱体积并收集洗脱液昧翔炎儡冷滚傈脱坠甸航唾校寄彝什娶浙许背较晦歌寡采羽陡顺炔枕护矽基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术（5）介质清洗用10倍体积0.5M NaOH过柱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30分钟以上。用10介质倍体积去离子水洗去层析柱中的碱液。用510倍介质体积平衡缓冲液A平衡层析柱。菠黄保瘫国凌哀咖想既庆泵兼驰拥越汤潜吗陇蹄却续对向蔽土焦镑尘诈虎基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术思考题：1、发酵培养后加入IPTG的作用是什么2、为什么要对包涵体进行洗涤？3、亲和层析液分光光度计检测结果分析4、纯化后得到的表达蛋白还可用哪些方法定性检测或定量检测？5、菌种活化和发酵培养时，培养基中加入抗生素的目的是什么？讨痘协祈萝渔忻龋会很蚕活桂攒晌绪柯贱牵身圈呛涪删天韦稗玫焕秉棍洱基因工程药物制备技术基因工程药物制备技术