GC脂肪酸分析MIDI试剂的准备和抽提步骤.docx

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1、TSBA 培育基是针对嗜氧菌(TSBA Media for Aerobes: TSBA6 数据库)Trypticase Soy Broth Agar(TSBA)培育基是嗜氧菌标准的培育基。利用以下的配方作为 TSBA 培育基。供货商被建议在附加数据(Appendix A)中。l 混合在 2 升的锥形瓶Trypticase soy brothGranulated agar Distilled Water30 grams15 grams1 literl 加热并搅拌至完全混合和琼脂(Agar)完全溶解l 在温度 121 度及 15psi 下高压灭菌 15 分钟留意事项：不行过度加热培育基，使用高压灭

2、菌器须有温度准时间的设定装置。l 在水浴中冷却至 60 度l 加 20-25 ml 在溶解的琼脂(Agar)分装至无菌 100 x 15mm 直径的培育皿中，琼脂须有2.5-3.2mm 深。l 允许琼脂在室温下凝固，但假设培育基想储存一段时间，必需在24 小时内包装在无菌装置中。它们可以保存在冷藏中直到使用。留意事项关于商业化已备好的TSBA 培育基：TSBA 可以从BBL 购置，但需要指定货号， 见附加数据(Appendix A)。使用其它供给商供给的TSBA 培育基可能会导致结果不全都，用户需要用ATCC 菌株验证培育基是否效果相当。3试剂的预备 (Reagent Preparation)

3、四种试剂要求是皂化细胞，脂化，萃取和根本洗涤脂肪酸的萃取物。试剂应预备在干净，棕色及可标示一公升的瓶子。放置一个 Teflon-coated 搅动台在每个瓶子上去添加在混合时。只有 Teflon 和玻璃可以接触到试剂。瓶子可以重使用不必要重浸润。自动分注的增加备置速度但是必需预备和确定适当的操作在每批样品使用前。确认分注试剂使用分注 试剂在有刻度的量筒以到达校正效果。以下的配方预备试剂约够 300 个样品或许可以在从前调整以够协作试验室的样品量，试剂预备用 VPI Anaerobe Method 和数据库在 Appendix B 中。留意事项: 试剂 1 和 4 是腐蚀性和试剂2 是酸性的全程

4、配戴安全眼镜及手套，hexane及 methyl-tert-butyl ether在(试MT剂BE3) 是可燃性的。熄灭全部的火焰或热源在使用前操作在一个化学性的抽气风盖之下。试剂 1-皂化试剂 (Ragent 1: Saponification Reagent)Sodium hydroxide (certified ACS)Methanol (HPLC grade) Deionized distilled water45 grams150ml 150mll 混合水和 methanol 参加 NaoH 小球到溶剂中同时搅拌至锭剂完全溶解试剂 2-甲基化试剂 (Reagent 2: Methyl

5、ation Reagent)6.00N Hydrochloric AcidMethanol (HPLC grade )325ml275mll 加酸液至 methanol 中搅拌留意事项: 盐酸(Hydrochloric Acid必) 须有保证浓缩。只有盐酸运送在玻璃瓶中是被允许的，和你的供给商争论包装的信息，请参考供给的建议A在ppendix A假设6.00N HCI无法取得资询你的制造商标示浓度在那批号上确认最终6.00N 的溶液滴定比照一个标准根底溶液。试剂 3-萃取溶剂 (Reagent 3: Extraction Solvent)Hexane (HPLC Grade )200mlMet

6、hyl tert-buty1 ether (HPLC Grade)200mll 参加 MTBE 在 hexane 中并搅拌均匀试剂 4-碱洗涤 (Reagent 4: Base Wash)Sodium hydroxide (Certified ACS)Deionized distilled water10.8g900mll 参加 NaOH 在水中同时搅拌至完全溶解额外的试剂 (Additional Reagents)l Saturated NaCl:溶解 40g 的 ACS NaCl 在 100ml 的去离子水中试剂的保存及有效期限 (Reagent Storage and Shelf Lif

7、e)建议每 30 天泡制的试剂。可在瓶中保存在室温下使用 Teflon-lined 盖子。储存移吸管在干净的容器中。全部试剂必需标示完全包括配制日期和过期日为一个月，纯洁的试剂必需确认在预备试剂掌握的空白比照组(过程不加任何组织物)在每次跑样品时。但不使用时，移开移吸管从试剂 1 (皂化试剂)瓶和利用打气的方式润丝清洁，利用去离子水去预防抓住活塞盖上用一个干净的Teflon-lined 螺旋盖。试剂 3，萃取的溶剂是可燃性的和必需储在良好的化学性的抽气风盖之下或溶剂排气柜。预备萃取: 5 个根本步骤(Preparing Extracts: Five Basic steps):每个样品放在单一试

8、管中经过萃取的过程，每批可预备50 个样品以增加便利性。萃取过程中的每个过程都摘要显示在图2-4。1 获菌(Harvesting)四区画线方法是被设计为稀释接种所以此四区会维持良好的分别菌落去供给操作人 员判别是否为纯化菌落。菌落必需获菌从大都稀释的区域表现集合成长 (late log 期)单独的条纹轴。获菌这些区域典型的区块有大多取稳定的脂肪酸成份来自于接种曾被只够的稀释去引起在充分的成长的菌落不需限制的养分补给。最正确的获菌的区域在第三区。留意事项: 最正确的获菌区域为第三区。成长较慢的微生物或许需要增加每次利用接种环在以下的四区划线技术通过二次增 加为四至六次。或许也可利用取其次区的微生

9、物。假设从培育皿中正确的区域取出微生物但会引起极差的数据库吻合，从第三区取出的微生物是最正确的；然而，假设较须生长的微生物也可从第 1 及 2 区取出。从培育皿中取出要培育的微生物，轻括培育皿的外表利用无菌 4mm 接种环。当稍微的转动接种环利用前后移动取出菌落。一个积存 4mm 接种环(约 40mg)湿重的菌落充分的原料的过程。有些培育将不会粘着良好在金属的接种环。塑料的接种环，Pasteur pipette 融解在小的接种环，或较小直径的白线环可以用来获菌这样的培育。确信维持一样份量的微生物一样于积存 4mm 接种环供给的。可以经由显具的总区域计数在最终的报告中或太少量的操作微生物会被判定

10、出。留意事项: 在下一个步骤执行前确认盖子必需完成吻合试管。l 放入接种环夹带者菌体进入一个干净，枯燥 13mmx100mm 有螺旋盖的培育试管。抹拭菌种脱离接种环在内底部的外表约在培育管底部约10mm 的地方。移开及无菌接种环。l 假设未做请确认培育管中有标示萃取的号码(从 Extriction Log Sheet)全都性的获菌培育皿。利用试验专用的笔直接写在玻璃上。假设足够的从前清洁，培育管可以再使用获得微生物从每个培育皿中在每批皂化的步骤之前。2 皂化(Saponification)猛烈的甲醇根底件随着加热杀菌及溶解细菌。脂肪酸将切割从细胞的脂质和转变到它们的钠盐。留意事项: 利用沸腾或

11、循环的水浴。加热板或其它加热的方式意指不用适当的加热的转移移和温度掌握在此步骤.。图 2-7-皂化步骤l 注入 1.00.1ml 的试剂 1，以甲醇为根底参加此次全部的样品。l 锁 紧 每 个 试 管 利 用 一 个 干 净Telfon-lined 螺旋盖子。l 震荡试管 5-10 秒。l 此批的全部样品试管在试管架上放入沸水或循环水石95-100的水浴中。留意事项: 加热已锁紧的试管会产生压力划伤或裂缝玻璃制品能够裂开。建议加热时利用化学安全盖或利用塑料盾。全程穿戴安全护目镜。l 五分钟之后，从沸腾的水中移开试管并稍微的冷却它不要翻开盖子，震荡每支试管 5-10秒再放试管回水浴中。l 确认试

12、管漏损,此刻是否有气泡在试管中升起为证据,再栓紧有漏的试管的盖子，假设继续发泡，样品必需在室温下回到室温的温度然后转移到的培育试管。l 连续加热这些试管在水浴中增长到 25 分钟。l 皂化在水浴中总共约 30 分钟以后，移开和放置试管架在冷却轻拍平底去冷却。冰水是不被建议使用的。3 甲基化(Methylation)甲基化转换脂肪酸(as sodium salts)成甲基脂脂肪酸(fatty acid methyl esters),以增加脂肪酸的挥发性以供 GC 分析利用。图 2-8-甲基化步骤l 开盖参加 Reagent 2，2.00.1ml 为甲基化试剂，注入每个试管。l 栓紧盖子震荡液体

13、5-10 秒。由于过量试剂，颗粒促使加快(salt)或许含形成。连续前进必需跟随：l 水浴加热试管 80, 10 分钟。l 移开且快速冷却至室温利用一槽冷水龙头水不建议使用冰水，摇摆试管促成 至冷却的过程。留意事项:超过时间和温度在此步骤期间可以降低环丙烷抑制成份，可以变更脂肪酸的描绘和被取名的微生物。4 萃取(Extraction)甲基脂脂肪酸移出从酸性似水部份和转移到一个有机的部份伴随着液体的萃取过程。留意事项: Hexanel/MTBE是可燃的。熄灭全部可燃物和当此些溶(剂solvents)为燃烧来源。图 2-9-萃取步骤6l 参加 1.250.1ml 的试剂 3-萃取溶剂在每个试管中。

14、l 盖紧盖子，放此批的试管在一个试验室的旋转器及温顺混合旋转10 分钟。l 翻开管盖，利用干净的 Pasteur Pipette 取出每个样品的移开及丢弃似水(下面)部位。5. 根本洗涤(Base Wash)一种稀释根底的溶液添加到样品的前处理管中去移去自由的脂肪酸和剩余试剂从有机的萃取中。剩余试剂将会损坏色谱分析的系统，会引起在末尾和损失氢气甲基脂脂肪酸(hydroxy fatty acid methyl esters)。图 2-10-根本洗涤步骤l 参加 3.00.21ml 试剂 4，根本洗涤至每个试管。l 栓紧盖子和温顺地震荡试管利用旋转的方式 5 分钟。l 短暂约三分钟的离心在 202

15、3 rpm 被建议。当乳状液被呈现出访用两层液面的接口更清楚。留意事项: 检试萃取试管和水温在参加试剂前。选择地:少数滴的标准 ACS 等级 NaCl/水溶液可添加在试管中以增加切断乳剂。握着试管置垂直状和震荡它快速地介于在两手掌间，并且允许它停留数分钟。萃取物移至样品小瓶(Transfer of Extract to Sample Vial)l 标示样品小瓶以供萃取鉴定。操作人员必需使用添加数目或部份的信息来自于”Sample ID” 区域中来自于萃取记录单(Extraction Log Sheet)独一的帮助样品瓶登入和在萃取记录单一样。留意事项: 螺旋盖子的样品小瓶也可使用或可简洁的来自

16、于试验室供给的公司。利用试验9室专用笔去标示样品小瓶胶带标示将不行靠。因此在样品瓶和或许操作干扰自动液体采样器瓶子夹子。l 翻开每个试管的盖子，利用干净的Pasteur pipette 在每个样品中，移出下层有机体约2/3 从每支试管中移到干净的GC 样品小瓶。两层的液面有时会不易观察，必需留神不行取出任何似水部份(下面)部份进入自动的样品小瓶。l 定型盖子在样品小瓶上。l 确认盖子严密在瓶上试子转动盖子当握着此小瓶。必需闪避出粗糙扭转要求小的上方螺旋瓶子，假设太松，调整盖子加盖器具(Stop screw in the handle)和重定型样品小瓶。当全部的样品萃取液移至样品小瓶中，操作人员

17、必需已经输入自动采样及开头执行样品下一章将会争论此点。延迟样品前置处理(Delay During Sample Preparation)抱负中，样品的过程必需持续执行非中断当菌种被获菌后。假设有必要延迟样品处理的步骤，有几个步骤是当样品可以停在那引发较少的在分析脂肪酸的影响。l 依照获菌步骤在参加reagent 1 之前，样品可被保存在培育中 12 个小时或快速冷冻。假设有大量的样品要被处理，将培育皿取出从培育箱中在一小群中和获得菌种。将样品 放在样品前处理试管中维持菌种在瓶中，放回培育箱或冷冻试管和堆另一群在培育皿 中。当全部的培育皿都完成此过程，移开全部的试管从储存处并且再做皂化步骤。l 在经过甲基化，萃取的步骤是不能够被延迟必需马上萃取。l 在萃取过后，移开似水部份，有机部份可以被维持在冷藏隔夜。l 样品将降低在接触在根本洗涤 (试剂 4)快速的移开上层。l 完成萃取，在定型上层GC 小瓶，可以冷藏数天在GC 分析前l 随着 GC 分析，萃取物可以存在冷藏中数目换置的穿洞的间隔(septum)去减至最少溶剂通过挥发。