实时荧光定量PCR的原理和应用课件.pptx

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1、实时荧光定量PCR的原理和应用目录 实时荧光定量PCR原理PCR荧光标记 绝对定量和相对定量 实时荧光定量PCR应用 实时荧光定量PCR发展digital PCR,qPCR Array实时荧光定量PCR原理聚合酶链式反应Polymerase chain reaction(PCR)1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引 物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因。1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚 合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐 热，

2、使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随 后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发 明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔 化学奖。聚合酶链式反应Polymerase chain reaction(PCR)PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链结合引物子链延长PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCAT

3、CGACGCTGGATCG35DNA解旋解链结合引物子链延长GGAUCG 55 AUCGCG33DNA聚合酶DNA聚合酶PCRATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG553DNA解旋解链结合引物子链延长TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGAUCG5AUCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC33DNA聚合酶DNA聚合酶PCR原理1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段 扩增100万倍以上DNA单链 与引物复性DNA双螺旋DNA2变性

4、 形成 条单链子链延伸DNA加倍模板DNA第一轮扩增第二轮扩增第三轮扩增第四轮扩增第五轮扩增实时荧光定量PCR在在P PC CR R反反应应体系体系中中加入加入荧荧光基光基团团，利，利 用用荧荧光光信号信号累累积积实实时时监测监测整整个个P PCRCR进进程，程，最后最后通通过过标标准曲准曲线线对对未未知知模板模板进进行定行定 量量分分析的析的方方法。法。实时荧光定量PCR和常规PCR常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产 物进行定量和定性分析。无 法对起始模板准确定量，无 法对扩增反应实时检测。实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个 循环扩增产物量的变化，

5、通 过Ct值和标准曲线的分析对 起始模板进行定量分析。荧光PCR特点灵敏度高灵敏度高特异性特异性强强全封全封闭闭PCRPCR过过程，无需后程，无需后处处理理即即时时反映反映扩扩增增过过程，摒弃程，摒弃终终点数据，更适用于定量点数据，更适用于定量定量范定量范围宽围宽，可达到，可达到1010个数量个数量级级，无，无须须稀稀释样释样品品可可实现实现一管多一管多检检仪仪器自器自动动分析，更快分析，更快获获得得结结果果实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR原理CtCt值值的的定定义义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)valueCt值的重现性横轴：PC

6、R反映循环数纵轴：荧光信号量CtCt值值的特的特点点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不 恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理-定量原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理-定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct =M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:lg M=lg X0(1+Ex)Ct整理方程式(2)得:(2)lg X0=-Ct

7、lg(1+Ex)+lg M(3)LgLg浓浓度度与循与循环环数呈数呈线线性关系，根据性关系，根据样样品品扩扩增达到增达到域域值值 的循的循环环数即数即Ct值就就可可计计算出算出样样品中所含的模板量。品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理-定量原理 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即 Ct值越小。Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以 计算出样品中所含的模板量。4039383736353433323130292827262524232221201918171615110100100010000CopCopy y NumNum

8、bersbers100000100000010000000C(tC(t)ValValueueStStandarandard d CurCurveve实时荧光定量PCR原理-相对定量XCt=X0(1+Ex)Ct,x=Kx RCt=R0(1+ER)Ct,R=KRXCtRCtR0(1+ER)Ct,RX0(1+Ex)Ct,xK=x =K KR=X0R0(1+E)Ct,x-Ct,R=KXN (1+E)Ct =KXN=RX00Ex=ER=E:XN=K(1+E)-CtXN,q =K(1+E)-Ct,qK(1+E)-Ct,cb=XN,cb(1+E)-Ct Ct=Ct,q-Ct,cb样本q的XN除以校准样本（C

9、alibrator）cb的XN：靶核酸：参比内标：Ct=Ct,x-Ct,R：实时荧光定量PCR原理-相对定量Livak&Schmittgen,Method,2001,25:402-408绝对定量和相对定量绝对绝对定量：精确的定量：精确的计计算初始反算初始反应应的模的模板板浓浓度度（DNA，RNA）病毒病毒DNA或或RNA的拷的拷贝贝数数转转基因的拷基因的拷贝贝数数相相对对定量：定量：计计算初始反算初始反应应模板模板的的相相对对含含量量差异表达分析差异表达分析芯片芯片评评估估转转基因生物的基因生物的检测检测基因型基因型检测检测荧光标记非特非特异性异性荧荧光光标标记记：1、SYBR Green 2

10、、EvaGreen 3、LCGreen特异特异性性荧荧光光标记标记：2、TaqMan3、Molecular Beacon4、AmplisensorRQQSYBR GREEN ISYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreenSYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧 光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBR GREEN 熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTmSYBR GREEN 熔解曲线分析融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量

11、准确融解曲线分析，有杂峰其他产物出现非特异性 荧光，因此定量不准确非特异非特异性性产产 物物SYBR GREEN法优缺点 对DNA模板没有选择性-适用于任何DNA 使用方便-不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜优 点缺 点 容易与非特异性双链DNA 结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分 析，优化反应条件 对引物特异性要求较高FRET当某个当某个荧荧光基光基团团的的发发射射谱谱与另一与另一荧荧光基光基团团的吸收光的吸收光谱发谱发生重叠，且两个基生重叠，且两个基 团团距离足距离足够够近近时时，能量可以从短波，能量可以从短波长长（高能量）的（高能量）的荧荧光基光基团传递团传递到到长长波波长长（低能量）

12、的（低能量）的荧荧光基光基团团，这这个个过过程称程称为荧为荧光共振能量光共振能量转转移移(FRET)(FRET),实际实际相当相当 于将短波于将短波长荧长荧光基光基团释团释放的放的荧荧光屏蔽。光屏蔽。Taq man探针与目标序列互补 5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光（荧光共振能量转移原理，FRET）Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针Taq man 探针 特异性特异性荧荧光光 双双标记标记探探针针Taq酶酶 5 53 3外切外切 酶酶活活性性T

13、aq man 探针法优缺点 对目标序列的高特异性-阴性结果确定 设计相对简单-与目标序列某一区 域互补重复性比较好优 点只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺 点Molecular Beacon 分子信标环标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成茎荧光素淬灭剂Molecular Beacon 分子信标Molecular Beacon 分子信标高特异性高特异性：对目标 序列检测SNP最灵敏的试 剂之一荧荧光背景低光背景低优 点缺 点只能用于一个特定目标设计困难价格比较高高分辨率熔解曲线High resolution melting cure(HRM)Ree

14、d et al.Pharmacogenomics(2007)8(6),597608实时荧光定量PCR应用实时荧光定量PCR应用基因扩增扩增特异性分析基因定量分析基因检测基因分型SNP分析RFLP多态性分析单/多基因表达研究高通量基因表达谱研究疾病的早期诊断 免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临 床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体 的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如 HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾 病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的 DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏 度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。病原体检测：确定病原体的种类和基因型，以利于治疗方

15、案的确定遗传疾病的早期诊断 荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入 突变、多基因突变等的检测，对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优 育，提高人口素质。药物研究 任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价 其疗效均不够敏感和及时，若以病毒复制的 被抑制程度，即病毒基因水平的高低和动态 变化来评价疗效，则较为直接和理想。新药筛选：药物作用靶标的研究，基因表达 的变化 药效的评价：对服药后体内基因表达或病原体载量的变化进行监控，更好的评价药效，有助于治疗方案的改进肿瘤的诊断可对原癌基因的突变和易位等作出检测；可对原癌基因的mRNA进行定量分析；有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断；探索癌变

16、发生机理的研究提供参考；区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。食品安全 病原微生物检测：对食品中可能存在的病原 微生物进行定量检测，保护人民生命安全 转基因食品检测 动物疫病检测：为防止动物疫病的传播和人 畜共患疾病的控制提供检测方法实时荧光定量PCR发展Digital PCRqPCR ArrayqPCR arrayGene Coponiea公司的All-in-OneTM Human Whole Genome miRNA Q-PCR ArrayOrigene公司的TissueScan Tissue qPCR ArraysSABiosciences公司的 RT2 ProfilerTM PCR Array SystemThe End Thank You!实时荧光定量PCR原理-定量原理可编辑可编辑