基因工程及应用课件.ppt
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1、溧阳市埭头中学溧阳市埭头中学孙定川孙定川随着社会的发展,人们的需求越来越趋于多样化,人们希望按照随着社会的发展,人们的需求越来越趋于多样化,人们希望按照自己的意图改变物种的基因,以期获得新的性状、得到新的生物自己的意图改变物种的基因,以期获得新的性状、得到新的生物产品。经典遗传学主要通过自然选育来挑选已发生自发突变的新产品。经典遗传学主要通过自然选育来挑选已发生自发突变的新变种;通过用物化因子(如辐射、药物处理等)来进行人工诱变,变种;通过用物化因子(如辐射、药物处理等)来进行人工诱变,得到所需的性状;通过细胞杂交使得某种突变性状得以显现,从得到所需的性状;通过细胞杂交使得某种突变性状得以显现
2、,从而寻找新类型。但所有这些,都具有相当大的偶然性,效率不高,而寻找新类型。但所有这些,都具有相当大的偶然性,效率不高,难以真正看到基因。由于经典遗传学所研究的基因不能离开染色难以真正看到基因。由于经典遗传学所研究的基因不能离开染色体而独立进行复制,所以基因拷贝数的增加是有限的;由于染色体而独立进行复制,所以基因拷贝数的增加是有限的;由于染色体减数分裂受同源性的支配,远缘杂交难以实现。人们强烈希望体减数分裂受同源性的支配,远缘杂交难以实现。人们强烈希望新的育种方式出现。在疾病防治方面,有许多严重威胁人类健康新的育种方式出现。在疾病防治方面,有许多严重威胁人类健康的病症,如遗传性疾病、心血管病、
3、恶性肿瘤、免疫系统疾病等,的病症,如遗传性疾病、心血管病、恶性肿瘤、免疫系统疾病等,病因还不太清楚。解决这些问题,必需依赖于生命科技甚至整个病因还不太清楚。解决这些问题,必需依赖于生命科技甚至整个科学技术的革命科学技术的革命.在上世纪中下叶,科学进步的机遇终于到来,这就是分子生物学在上世纪中下叶,科学进步的机遇终于到来,这就是分子生物学理论的创立和突破性进展,特别是基因工程(遗传工程)理论的创立和突破性进展,特别是基因工程(遗传工程)-DNADNA体外重组技术的出现。体外重组技术的出现。生物之所以体现出各种形态是基因表达的结果,各生物之所以体现出各种形态是基因表达的结果,各种生物间的性状千差万
4、别这是为什么呢?种生物间的性状千差万别这是为什么呢?问题:问题:例:例:1青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素。青霉素。2豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮气。豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮气。3人的胰岛人的胰岛B B细胞能分泌胰岛素调节血糖的浓度。细胞能分泌胰岛素调节血糖的浓度。小结小结:这些性状都是基因特异性表达的结果:这些性状都是基因特异性表达的结果 人类能不能改造基因呢?能不能使本身没有某个性状人类能不能改造基因呢?能不能使本身没有某个性状的生物具有某个特定性状呢?的生物具有某个特定性状呢?问题问题:标准概念标准概念:在在生物体外生物体外,通过对,通过
5、对DNA分子分子进行人工进行人工“切割切割”和和“拼接拼接”,对生物的,对生物的基因基因进行改造和重新组合,然后导入受体细胞进行改造和重新组合,然后导入受体细胞内进行无性繁殖,使重组基因在受体细胞内表达,产生出内进行无性繁殖,使重组基因在受体细胞内表达,产生出人类所人类所需要的基因产物需要的基因产物。因此,基因工程又叫做因此,基因工程又叫做基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重组技术重组技术一、基因工程的概念一、基因工程的概念 通俗概念:通俗概念:按照人们的意愿,把一种生物的个别基因复制出来按照人们的意愿,把一种生物的个别基因复制出来加以修饰改造,然后放到另一种生物的细胞里,加以修饰改造,
6、然后放到另一种生物的细胞里,定向地改造定向地改造生物生物的遗传性状。的遗传性状。基因工程的基因工程的别名别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达人类需要的基因产物人类需要的基因产物一、基因工程的基本内容一、基因工程的基本内容基因工程,兴起于基因工程,兴起于2020世纪世纪7070年代。人类实现对基因进年代。人类实现对基因进行自如地操作、转移和改造的理想,是在核酸限制性行自如地操作、转移和改造的理想,是在核酸限制性内切酶、载体质粒、连
7、接酶和其它修饰酶被陆续发现内切酶、载体质粒、连接酶和其它修饰酶被陆续发现以后。在此基础上,核酸和蛋白质序列测定、基因体以后。在此基础上,核酸和蛋白质序列测定、基因体外快速突变、外快速突变、DNADNA的人工合成等,则使得基因工程逐的人工合成等,则使得基因工程逐渐成熟和发展。渐成熟和发展。通过对基因工程概念的理解,我们知道其操作水平是在通过对基因工程概念的理解,我们知道其操作水平是在DNA分分子水平,用普通的操作工具能够在如此微观的条件下操作吗?子水平,用普通的操作工具能够在如此微观的条件下操作吗?问题:问题:基因操作的工具基因操作的工具苏云金芽孢杆菌(有抗虫特性)苏云金芽孢杆菌(有抗虫特性)抗
8、虫基因抗虫基因普通棉花(无抗虫特性)普通棉花(无抗虫特性)棉花细胞(含抗虫基因)棉花细胞(含抗虫基因)导入导入与运载体与运载体DNA拼接拼接棉花植株(有抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)关键步骤一:关键步骤一:抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取关键步骤二:关键步骤二:抗虫基因与运载体抗虫基因与运载体DNA连接连接关键步骤三:关键步骤三:抗虫基因进入棉细胞抗虫基因进入棉细胞关键步骤一的工具:关键步骤一的工具:基因的剪刀基因的剪刀限制性内切酶限制性内切酶关键步骤二的工具:关键步骤二的工具:基因的针线基因的针线DNA连接酶连接酶关键步骤三的工具:关键步骤三的工具:基因
9、的运输工具基因的运输工具运载体运载体思考:关键步骤是什么?(难题)思考:关键步骤是什么?(难题)分布:分布:作用特点:作用特点:结果:结果:举例:举例:主要在微生物中主要在微生物中。特异性。特异性。一种限制酶只能识别一种特定核苷酸一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列,在特定的切点上切割序列,在特定的切点上切割DNA分子。分子。产生黏性未端(碱基互补配对)。产生黏性未端(碱基互补配对)。大肠杆菌的一种限制酶能识别大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列,序列,并在并在G和和A之间切开。之间切开。思考题:要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶思考题:要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几
10、个切口切几个切口?可产生可产生几个几个黏性未端?黏性未端?(1)基因的剪刀)基因的剪刀限制性内切酶(简称限制性内切酶(简称限制酶限制酶)限制酶切割限制酶切割DNA分子示意图分子示意图DNA连接酶的连接作用示意图连接酶的连接作用示意图被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口,带有两条单链的切口,带有几个伸出的核几个伸出的核苷酸苷酸,它们之间,它们之间正好互补配对正好互补配对,这样的切口叫做,这样的切口叫做黏性未端黏性未端。可以设想,如果把两种来源不同的可以设想,如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来用同一种限制酶来切割,然后让两者的黏性未端黏合起来,似乎就可以合成切割,然
11、后让两者的黏性未端黏合起来,似乎就可以合成重组的重组的DNADNA分子分子了。但是,实际上仅仅这样做是不够的,了。但是,实际上仅仅这样做是不够的,互补的碱基处虽然连接起来互补的碱基处虽然连接起来,但是这种连接只相当于把断,但是这种连接只相当于把断成两截的梯子中间的成两截的梯子中间的氢键氢键(踏板踏板)连接起来,连接起来,两边的扶手两边的扶手的断口处的断口处还没有连接起来。要把还没有连接起来。要把磷酸二酯键磷酸二酯键(扶手扶手)的断的断口处连接起来,也就是把口处连接起来,也就是把两条两条DNADNA未端之间的缝隙未端之间的缝隙“缝合缝合”起来,还要靠另一种极其重要的工具起来,还要靠另一种极其重要
12、的工具DNADNA连接酶连接酶。(2)基因的针线)基因的针线DNA连接酶(连接酶(图示图示)DNA连接酶的连接作用示意图连接酶的连接作用示意图连接的部位:连接的部位:结果:结果:思考题:思考题:磷酸二酯键(梯子的扶手),不是氢键(梯子的踏板)。磷酸二酯键(梯子的扶手),不是氢键(梯子的踏板)。两个相同的黏性未端的连接。两个相同的黏性未端的连接。用用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键?连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键?用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键?用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键?(2)基因的针线)基因的针线DNA连接酶(连接酶(图示图
13、示)(3)基因的运输工具)基因的运输工具运载体(运载体(图示图示)作用:作用:具备的条件:具备的条件:种类:种类:将外源基因送入受体细胞。将外源基因送入受体细胞。能在宿主细胞内复制并稳定地保存。能在宿主细胞内复制并稳定地保存。具有多个限制酶切点。具有多个限制酶切点。具有某些标记基因。具有某些标记基因。质粒、噬菌体和动植物病毒。质粒、噬菌体和动植物病毒。大肠杆菌质粒的分子结构示意图大肠杆菌质粒的分子结构示意图质粒能够质粒能够“友好友好”地地“借居借居”在宿主细胞中。一般来说,在宿主细胞中。一般来说,质粒的质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用,但是,但
14、是,质粒的复制质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。则只能在宿主细胞内完成。质粒是基因工程最常质粒是基因工程最常用的用的运载体运载体,它存在于许,它存在于许多多细菌细菌以及以及酵母菌酵母菌等生物等生物中,是中,是细胞染色体外细胞染色体外能够能够自主复制的很小的环状自主复制的很小的环状DNADNA分子分子,最常用的质粒,最常用的质粒是是大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒。大肠。大肠杆菌的质粒中常含有抗药杆菌的质粒中常含有抗药基因,如抗四环素的标记基因,如抗四环素的标记基因。细菌质粒的大小只基因。细菌质粒的大小只有普通细菌染色体有普通细菌染色体DNADNA的的百分之一左右。百分之一左右。质粒质粒存在于许多细
15、菌及酵母菌等生物中。存在于许多细菌及酵母菌等生物中。质粒的存在对宿主细胞无影响。质粒的存在对宿主细胞无影响。质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒的复制只能在宿主细胞内完成。细胞染色体外能自主主复制的小型环状细胞染色体外能自主主复制的小型环状DNA分子。分子。思考题:思考题:1、质粒上会存在某些标记基因,这些标记基因有什质粒上会存在某些标记基因,这些标记基因有什么用途?么用途?质粒的特点:质粒的特点:基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤示示意意图图三、基因操作的基本步骤(三、基因操作的基本步骤(图示图示)问题:问题:举例说明什么是目的基因?获得目的基因的途径如何举例说明什么是目的基因?获得目的基
16、因的途径如何?从供体细胞从供体细胞DNA中直接分离基因的最常用的方法叫什中直接分离基因的最常用的方法叫什么?简要说出该方法的过程是什么?么?简要说出该方法的过程是什么?人工合成基因的方法有几种?其操作过程分别是什么人工合成基因的方法有几种?其操作过程分别是什么?从供体细胞的从供体细胞的DNA中中直接分离基因直接分离基因方法:鸟枪法方法:鸟枪法(1)鸟枪法的过程:)鸟枪法的过程:(一)提取目的基因的途径(一)提取目的基因的途径反转录法反转录法(2)反转录法的过程:)反转录法的过程:根据已知氨基酸序列根据已知氨基酸序列合成合成DNA人工合成基因(真核细胞)人工合成基因(真核细胞)运载体运载体供体细
17、胞中供体细胞中DNA许多许多DNA片段片段限制酶限制酶载入载入导入导入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状目的基因目的基因分离分离外源外源DNA 扩增扩增目的基因的目的基因的mRNA单链单链DNA反转录反转录双链双链DNA(即目的基因)(即目的基因)合成合成(3)根据已知氨基酸序列合成)根据已知氨基酸序列合成DNA的过程的过程蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因目的基因推测推测化学合成化学合成推测推测DNA合成仪合成仪另一条途径是另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列,推根据已知的蛋白质的氨基酸序列,推测出相
18、应的信使测出相应的信使RNARNA序列序列,然后,然后按照碱基互补配对按照碱基互补配对原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列,再通过再通过化学方法,以单核苷酸为原料合成目的基因化学方法,以单核苷酸为原料合成目的基因。如人。如人的血红蛋白基因,胰岛素基因等就可以通过人工合的血红蛋白基因,胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。成基因的方法获得。目前人工合成基因的方法目前人工合成基因的方法主要有两条途径。一条途主要有两条途径。一条途径是径是以目的基因转录成的以目的基因转录成的信使信使RNARNA为模板为模板,反转录反转录成互补的单链成互补的单链DNADNA,
19、然后,然后在酶的作用下合成双链在酶的作用下合成双链DNADNA,从而获得所需要的从而获得所需要的基因。基因。目的基因是指人们所需要的特定基因,有两条途径。目的基因是指人们所需要的特定基因,有两条途径。鸟枪法鸟枪法,其过程是:,其过程是:此法的此法的优点优点:操作简便:操作简便 缺点缺点:工作量大,专一性较差,分离出来的有时:工作量大,专一性较差,分离出来的有时 并非一个基因,具有一定的盲目性。并非一个基因,具有一定的盲目性。人工合成基因法人工合成基因法1反转录法:目的基因反转录法:目的基因 mRNA 单链单链DNA 双链双链DNA转录转录逆转录逆转录互补合成互补合成供体细胞中的供体细胞中的DN
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