DB64∕T 1516-2017 肉及肉制品中犬源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法(宁夏回族自治区).pdf

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1、DB64宁夏回族自治区地方标准DB64/T15162017肉及肉制品中犬源性成分定性检测方法 实时荧光PCR法Identification of canine derived materials in meat and meat productsReal-time PCR method201771-22 发布 2018-02-22 实施宁夏回族自治区质量技术监督局 发布DB64/T 1516-2017刖 s本标准编写格式符合GB/T 1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写的要求。本标准由宁夏回族自治区食品药品监督管理局归口。本标准由宁夏回族自治区食品检测中心起草。本标准主要起

2、草人：岳苑、贾冰凝、何微、吴明、张慧玲、高俊峰。IDB64/T 15162017肉及肉制品中犬源性成分定性检测方法实时荧光PCR法1范围本标准规定了肉及肉制品中犬源性成分实时荧光PCR检测方法。本标准适用于肉及肉制品中犬源性成分的定性检测。该检测方法的检出限为0.1%。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的=凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27025检测和校准实验室能力的通用要求GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语

3、和定义、缩略语下列术语和定义、缩略语适用于本标准。3.1术语和定义3.1.1犬源性成分 canine-derived mater i a I s犬种属特异性DNA片段。3.1.2实时荧光 PCR real-time fluorescent PCR实时荧光聚合酶链式反应。3.1.3Ct 值 Cycle threshold Ct每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.1.4内参照 Internal Control在真核生物16sRNA的保守区域设计了内参照上下游引物和探针,探针的5,端标记竣基荧光素（FAM）,3,端标记荧光淬灭剂（TAMRA）。用于监控PCR反应是否正常进行以及

4、防止假阴性结果的出现。1DB64/T 15162017缩略语：DNA deoxyr i bonuIe i c ac i d脱氧核糖核酸。PGR polymer i se chain reaction聚合酶链式反应。Taq Thermus aquaticu水生栖热菌。FAM 6-carboxyfIuoresce i n6-竣基荧光素。TAMRA 6-CarboxytetramethyI rhodamine6-竣基四甲基罗丹明。4原理本标准采用实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA上动物种间多态性的差异而进行动物源性种类鉴定。通过标记荧光物质(FAM)的特异性探针进行特异性扩增，观察实时荧光PCR的

5、增幅曲线，从而对肉制品中 犬源性成分进行检测。5仪器设备5.1实时荧光PCR检测系统。5.2 高速冷冻离心机(转速12 000 r/min以上)。5.3核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。5.4 冰箱(2 8和-20。-80)。5.5 微量可调移液器：0.5吐10此，10此100pL,20叱200叱，100见1000此。5.6恒温加热器(4100)。5.7可移动紫外灯。5.8分析天平：感量为0.Imgo5.9高压灭菌锅。5.10干热灭菌器。5.11振荡器。6材料及试剂6.1材料6.1.1实时荧光PCR反应管。6.1.2微量可调移液器配置吸头：10此，200dL,1000比。2DB64/T 1516

6、20176.1.3离心管。6.2试剂除特别说明以外，所用试剂均为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂 均用无DNA酶污染的容器分装。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T 27025的规定。6.2.1基因组DNA提取试剂盒“：提取步骤及使用注意事项参见附录Ao6.2.2荧光定量PCR反应预混液L 使用方法及使用注意事项参见附录B。6.2.3引物及探针6.2.3.1内参照引物：5-gttcgtttgttcaacgattaa-3 5-agatagaaaccgacctggat-3 探针：FAM-ctccggtctgaactcagatcacgta-TAMRA6.2.3.2犬

7、源性成分引物：5,-gaagctcatgttatttattcg3,5-catgctttcgtaataatcttc-3 探针：FAM-cggagcaccaattattaacggca-TAMRA7抽样7.1采 样工具采样工具剪刀、镶子应经干热灭菌器180士20,2h高温灭菌。7.2样 品采集及储运样品采集后，将采集的样品放人无菌采样袋（一个采样点的样品放人一个塑料袋）或其他灭菌容器,编号，于保温箱中加冰、密封，送实验室。8操作方法8.1样品模板DNA的制备在样本制备区进行。提取步骤及使用注意事项参见附录A。8.2 DNA定量将DNA溶液做适当稀释,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260n

8、m和280nm处的吸光值。10D2601M=50读g/mL双链DNA或38Rg/mL单链DNA。DNA的浓度按照式（1）计算，当ODzeo/OMo比值在L 52.1 之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA稀释至lOng/回50ng/pL。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如其他等效产品具有相同的效果，则可 使用这些等效产品。3DB64/T 15162017C=AX NX 50/1000(1)式中：CDNA浓度，单位为ng/L;A260nm处的吸光值；N稀释倍数。8.3检测8.3.1扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。为确保检测结果的准确性，在进行实际样

9、品检测时，应设立空白对照、阴性对照和阳性对照实验。样品和内参照分别扩增。实时荧光PCR反应体系见表1。从荧光定量PCR反应 预混液（参见附录B）中取出相应的实时荧光PCR反应用试剂，融化后，瞬时离心5s。向每个实时荧光PCR 反应管中各分装23ML反应混合液（除模板DNA外），转移至上样区。表1实时荧光PCR反应体系试剂成分体积2X预混液12.5匹引物混合液IgL探针IgL样品 DNAdOng/nL-SOng/pL)2pL(ddH20)至 25|iL注1:空白对照实验时，用ddHzO替代样品DNA。注2:阴性对照实验时，用非目标源性成分替代样品DNA。注3:阳性对照实验时，用相应的犬的DNA替

10、代样品DNA。注4:ddH20要求去RNA酶。8.3.2加样在上样区进行。在各设定的实时荧光PCR反应管中分别加入制备的模板DNA溶液，盖紧管盖，瞬时离 心5s10s o8.3.3 实时荧光PCR检测在检测区进行。将本标准8.3.2中离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录 样本摆放顺序。循环条件设置：95 30s,1个循环，95 5s、60 30s,40个循环力在每次循环的退 火时收集荧光。检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。9结果判定与表述9.1结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整。9.2 结果的判定2）PCR扩增程序请根据实际

11、使用仪器型号参考PCR反应预混液说明书4DB64/T 151620179.2.1对照结果9.2.1.1空白对照：无FAM荧光信号检出，内参无FAM信号检出。9.2.1.2阴性对照：无FAM荧光信号检出，内参有FAM信号检出，Ct值应28。9.2.1.3阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，内参有FAM信号检出,Ct值均应28。9.2.2检测结果的判定Ct值小于等于35视为有效值，Ct值大于35视为无效值。犬源性成分检测结果的判定见表2。表2犬源性成分检测结果的判定情况待测样内参结果判定情况+同时进行的阴性、阳性、空白对照的实验结果正常，检测实际样品时，如果待测样 品和

12、内参均有FAM荧光检出，且Ct值W35,判定为含有犬源性成分；如果待测样品 Ct值35,且内参Ct值W35,可视为不含有犬源性成分。-+同时进行的阴性、阳性、空白对照的实验结果正常，检测实际样品时，FAM荧光信 号未检出，但是内参有FAM荧光检出，Ct值W35,判定为不含有犬源性成分。+-如果检测样品浓度高会抑制内参照DNA的扩增，可以将样品DNA稀释或重新提取样本 DNA后再扩增。-PCR反应失败。注意以下几个方面后再进行反应。如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则可能是样品DNA制备有问题，如样品 中可能存在PCR反应的抑制物等。如果同时进行的阳性对照实验结果不正常，则可能是实验操作失败或

13、是试剂失 活。9.3结果表述结果表述为：检出犬源性成分。未检出犬源性成分。10检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403执行。11废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。5DB64/T 15162017附录A（资料性附录）血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）的提取步骤和注意事项A.1血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒以某公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）为例。A.2提取步骤A.2.1吸取200比缓冲液GA于1.5mL离心管中，称取15mg30mg样品，加入离心管中，充分剪碎。A.2.2离心管中加入20业Proteinase K溶

14、液，56放置12h（每小时颠倒混合样品2次3次），直至 组织溶解，简短离心以去除管内壁的水珠。A.2.3加入200此缓冲液GB,充分颠倒混匀，70放置lOmin,溶液应变清亮，简短离心以去除管内壁 的水珠。A.2.4加入200此无水乙醇，充分振荡混匀15s,此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的 水珠。A.2.5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm（13400Xg）离心30s,倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。A.2.6向吸附柱CB3中加入500m缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm（13400X

15、g）离心30s,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。A.2.7向吸附柱CB3中加入600m漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm（13400Xg）离心30s,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。A.2.8重复操作步骤7。A.2.9将吸附柱CB3放回收集管中，12000 rpm（13400Xg）离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温 放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。A.2.10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50m200晨洗脱缓冲 液TE,室温放置2min5min,12000 rpm（13400Xg）离心2nl

16、in,将溶液收集到离心管中。A.3使用注意事项A.3.1取样时应多部位取样，注意样品的代表性。A.3.2进行样品处理时必须避免交叉污染。A.3.3操作时应带上无粉手套和口罩，避免DNA酶混入造成DNA分解。若污染皮肤、眼睛时，要立即用 大量清水冲洗，必要时应寻求医疗咨询。6DB64/T 15162017附录B（资料性附录）荧光定量PCR反应预混液Premix Ex Taq”的组成B.1荧光定量PCR反应预混液Premix Ex Taq以某公司的荧光定量PCR反应预混液为例。B.2预混液试剂组成预混液试剂组成见表B.1。表B.1预混液试剂组成试剂组成体积Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2XCone.)*11.0 mLROX Reference Dye(50XConc.)*2200 uLROX Reference Dye II(50 XCone.)*2200 uLB.3使用注意事项B.3.1使用制品时，应轻轻上下颠倒混合均匀，避免起泡，并轻微离心后使用。B.3.2溶解后的试剂应于冰上放置。B.3.3本制品中不含有荧光探针等。B.3.4反应液的配制、分装应使用新的（无污染）枪头，Microtube等，尽量避免污染。7