第七章-层析分离技术(7)反相层析ppt课件.ppt

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1、第七章 层析分离技术（7）中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识本章内容n 7.1 层析技术导论 n 7.2 凝胶过滤层析n 7.3 离子交换层析n 7.4 亲和层析n 7.5 固定金属离子亲和层析n 7.6 疏水作用层析n 7.7 反相层析中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析n 一、基本原理n 二、反相介质的种类n 三、特点及用途n 四、影响因素n 五、高效液相色谱简介中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及

2、由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析一、基本原理n 反相层析（Reversed-phasechromatography,RPC）利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差异进行分离纯化的层析技术。n 反相层析属于分配层析，溶质在固定相（非极性介质）和流动相之间的分配系数取决于溶质的疏水性：n 溶质的疏水性越大，其在固定相中的分配系数越大。n 烃类化合物的分配系数与其分子所含碳原子数成正比。n 当固定相一定时，可通过调节流动相的组成来调整溶质的分配系数。n 流动相的极性越大，溶质的分配系数越大。

3、n 因此，RPC多采用降低流动相极性（水含量）的线性梯度洗脱法。中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析二、反相介质的种类n 反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面键和非极性分子层。硅烷化反应式如下：其中，硅烷化试剂中R1和R2多为甲基，R为C4、C8、C18烷基或苯基，一般简称为C4、C8、C18柱等另外，高分子聚合物也可作为反相介质，如：聚丙烯酸酯-C18中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害

4、，提高师生的控烟意识7.7 反相层析三、特点及用途n 一般用非极性固定相（如C18、C8）；n 流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。n 为了得到更好的分离效果，有时加入一定浓度的三氟乙酸（TFA）n 适用于分离非极性和极性较弱的化合物。n RPC主要用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析与纯化。n 由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物大分子在RPC过程中容易变性失活。因此，以回收生物活性蛋白为目的时，应注意选择适宜的反相介质和流动相。

5、n 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。n 为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.57.5（28），n 太高的pH值会使硅胶溶解，n 太低的pH值会使键合的烷基脱落。n RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析三、特点及用途n 相似之处：n 均是利用不同物质与固定相之间的疏水性作用力不同进行色谱分

6、离。n 不同之处：n 固定相的疏水程度不同；n 流动相组成不同；n 操作方式不同；n 应用范围不同。反相色谱与疏水作用色谱的比较中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析四、反相层析的影响因素 在反相介质已经确定的情况下，影响反相层析分辨率的因素主要包括：流动相的组成、洗脱模式、层析柱尺寸、流速、温度等。1.流动相 2.洗脱模式 3.层析柱的尺寸 4.流速 5.温度中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识1.流动相n 1)

7、流动相的组成：流动相中的有机溶剂可降低流动相的极性，流动相极性越低，其洗脱能力越强，因此洗脱时通常采用的有机溶剂比例会逐渐提高，以使各样品组分按疏水性由弱到强的顺序洗脱；对有机溶剂的要求：与水互溶、由较低的紫外吸收及较低黏度（如乙腈、甲醇、乙醇等）。n 2）流动相的pH值：反相层析的流动相条件多在低pH值下（pH2-4）n 层析介质（如硅胶）在高pH下不稳定；n 很多组分在低pH下具有较好的溶解性；n 低pH抑制了样品组分中酸性基团及硅胶上硅醇基的解离；n 为了使流动相保持在低pH下，在流动相中加入酸（如三氟乙酸（TFA）。中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以

8、进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识2.洗脱模式n 由于溶质中不同组分的疏水性强弱不同，与固定相结合的牢固程度不同，在起始条件下，极性很强的组分不能结合在固定相上面直接被洗脱，其余组分结合在固定相表面，为了将这些组分洗脱下来，必须降低流动相的极性，即增加流动相中有机溶剂的比例。因此，反相层析的洗脱过程中流动相的组成随时间而变化。n 通常可采用阶段洗脱和梯度洗脱。最理想的洗脱条件是通过多次实验优化后得到的。中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识3.层析柱的尺寸n 层析柱的尺寸由其内径和柱长所决定，n

9、内径影响层析的规模，但对分辨率没有影响，n 柱长对分辨率的影响则与溶质的种类有关。n 对于小分子有机物，增加柱长可以提高柱效改善分辨率，n 而多肽、核酸等生物大分子对柱长的敏感程度较低。中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识4.流速n 流速对于反相层析的影响是多方面的，一般来说，流速对于小分子的分离影响较大而大分子对流速变化敏感性较低。n 通常过高的流速会导致涡流扩散严重，影响样品在固定相和流动相之间的平衡，导致洗脱峰宽度变大分辨率下降；n 但过低的流速可能会导致样品组分纵向扩散加剧，也会使分辨率下降，且分离时间

10、较长，不利于样品的稳定和较大规模的分离；中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识5.温度n 温度对于反相层析的分离结果有较大的影响。n 提高温度能够降低流动相的黏度，增加传质速度，减少区带变宽现象，从而改善分辨率。n 但是在分离生物大分子的时候必须考虑到分子的稳定性，因此不宜用太高的温度。中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析五、高效液相色谱简介n 1.基本原理n 2.特点n 3.应用n 4.高效液相色谱仪的组成n 5

11、.HPLC在蛋白分离中的应用及操作规程n 6.HPLC-RPC 在蛋白分离中的应用举例中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析五、高效液相色谱简介n 高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）与经典的色谱法（或层析法）的分离机制类似混合物在流动相和固定相之间的分配系数不同，在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出。1.基本原理中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施

12、以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析五、高效液相色谱简介n HPLC在经典液相色谱的基础上，采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度的检测器，具有高分辨率、高灵敏度、速度快、自动化程度高等优点。3.应用n HPLC被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。2.特点中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析五、高效液相色谱简介n（1）高压输送系统n（2）进样系统n（3）

13、分离系统n（4）检测系统及记录系统4.高效液相色谱仪的组成中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析五、高效液相色谱简介n 溶剂贮存器：贮存流动相（12L）n 高压泵：将贮存器中的流动相连续送入色谱系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。压力：042MPa，流速：0.00110ml/min。n 梯度洗脱装置：通过程序控制混合泵来使流动性的离子强度/pH/极性等发生梯度变化，提高分离效果和效率。4.高效液相色谱仪的组成（1）高压输送系统中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进

14、一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析五、高效液相色谱简介n 六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。n 工作原理：手柄装载(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。4.高效液相色谱仪的组成（2）进样系统LoadInject中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.

15、7 反相层析五、高效液相色谱简介n 柱管（柱壳）n 材质：玻璃柱、不锈钢柱n 柱长及柱内径：n 4.6mm150mm/4.6mm250mm（分析柱）n 柱内经25mm（制备柱）n 固定相（填料）n 类型：凝胶柱、离子交换柱、亲和柱和反相柱。n 孔径：根据样品分子量大小选择填料的孔径。分子量越小，孔径要求也越小；反之亦然。n 粒径：5m（标准），3.0 m/3.5 m（短柱）4.高效液相色谱仪的组成（3）分离系统中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识 7.7 反相层析五、高效液相色谱简介n 检测器：n 类型：紫外、

16、荧光、电导、pH等检测器。n 性能要求：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、响应快及对温度和流速不敏感等。n 记录系统：n 样品被分离成单个组分后，依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来或在电脑上显示。4.高效液相色谱仪的组成（4）检测系统及记录系统中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识7.7 反相层析五、高效液相色谱简介n（1）色谱柱的选择：根据被分离蛋白的性质，选择适当的分离模式和不同规格和性能色谱柱。n 凝胶色谱n 反相色谱n（2）样品液的准备：将分析样品转化为适

17、合HPLC直接进样的样品。n 样品制备步骤：取材匀浆预分离浓缩溶解n 保持蛋白活性的措施：低温操作、添加蛋白酶抑制剂等n 提高蛋白溶解性的措施：适当加入表面活性剂、变性剂等n 在进样之前最好用0.45m/0.22m膜过滤。n（3）流动相的选择：合适的极性、良好的选择性、与检测器匹配。n pH的选择：n 梯度洗脱条件的选择n 有机改良剂的加入：三氟乙酸（TFA）n 流动相的配制：互溶性、微孔膜过滤5.HPLC在蛋白分离中的应用及操作规程中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识 7.7 反相层析五、高效液相色谱简介6.HPLC-RPC 在蛋白分离中的应用举例中国历史上吸烟的历史和现状、所采取的措施以及由此带来的痛苦和灾难，可以进一步了解吸烟对人民健康的危害，提高师生的控烟意识思考题n 1.反相层析的基本原理是什么？n 2.分析反相层析与疏水作用层析的区别与联系。n 3.高效液相色谱的原理和特点是什么？n 4.高效液相色谱仪有哪几部分组成？