酵母双杂交系统技术介绍ppt课件.ppt

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1、酵母双杂交酵母双杂交系统系统技术介绍技术介绍 06 June 2023 宝日医生物技术（北京）有限公司宝日医生物技术（北京）有限公司酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍2 26/6/20236/6/2023主要内容主要内容酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的基本原理酵母双杂交的基本原理Clontech Clontech 酵母双杂交系统酵母双杂交系统常见问题分析常见问题分析酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍3 36/6/20236/6/2023背景介绍背景介绍:关注蛋白质关注蛋白质蛋白质蛋白质相互作相互作用研究用研究蛋白组时蛋白组时代代蛋白质功蛋白质功能能生物信

2、息生物信息学的发展学的发展酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍4 46/6/20236/6/2023背景介绍背景介绍:为什么要研究蛋白互作？为什么要研究蛋白互作？发现新的蛋白质和蛋白质的新功能发现新的蛋白质和蛋白质的新功能在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用筛选药物的作用位点筛选药物的作用位点研究药物对蛋白质之间相互作用的影响研究药物对蛋白质之间相互作用的影响建立基因组蛋白连锁图建立基因组蛋白连锁图酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍5 56/6/20236/6/2023背景介绍背景介绍:Clontech:Clontech 酵母双杂交系统的功能酵

3、母双杂交系统的功能发现新的与已知蛋白互作的蛋白发现新的与已知蛋白互作的蛋白鉴定两个蛋白之间的相互作用鉴定两个蛋白之间的相互作用确定蛋白相互作用的区域确定蛋白相互作用的区域酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍6 66/6/20236/6/2023背景介绍背景介绍:Clontech:Clontech分子生物学工具分子生物学工具ClontechMatchmakerMatchmakerGeneGeneFunctionFunctionGeneGeneExpressionExpressionGeneGenediscoverydiscovery酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍7 76/6

4、/20236/6/2023背景介绍背景介绍:Matchmaker Gold:Matchmaker Gold 系统系统Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System System（630491630491）酵母单杂交酵母单杂交-蛋白与蛋白与DNADNA的相互作用的相互作用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid SystemMatchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System（6

5、30489630489）Make your own“Mate&Plate”library System(630490)Make your own“Mate&Plate”library System(630490)酵母双杂交酵母双杂交-蛋白与蛋白的相互作用蛋白与蛋白的相互作用pBridge Three-Hybrid Vector pBridge Three-Hybrid Vector（630404630404）酵母三杂交酵母三杂交三个蛋白之间的相互作用三个蛋白之间的相互作用酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍8 86/6/20236/6/2023背景介绍背景介绍:Matchmaker:M

6、atchmaker GoldGold系统原理系统原理Reporter Gene酵母单杂交酵母单杂交酵母双杂交酵母双杂交酵母三杂交酵母三杂交Reporter GeneReporter Gene酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍9 96/6/20236/6/2023主要内容主要内容酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的基本原理酵母双杂交的基本原理Clontech Clontech 酵母双杂交系统酵母双杂交系统常见问题分析常见问题分析酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍10106/6/20236/6/2023基本原理基本原理:酵母双杂交参考文献酵母双杂交参考文献Nat

7、ureNature.1989 Jul 20;340(6230):245-6.1989 Jul 20;340(6230):245-6.A novel genetic system to detect protein-protein interactions.A novel genetic system to detect protein-protein interactions.Fields SFields S,Song OSong O.Department of Microbiology,State University of New York at Stony Department of M

8、icrobiology,State University of New York at Stony Brook,Stony Brook 11794.Brook,Stony Brook 11794.63000次引用酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍11116/6/20236/6/2023基本原理基本原理:GAL4:GAL4转录因子的结构转录因子的结构ADADDNA-BDDNA-BDGAL4 GAL4 蛋白具有两个功能结构域蛋白具有两个功能结构域BDBD结合结构域结合结构域ADAD激活结构域激活结构域酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍12126/6/20236/6/2023基本

9、原理基本原理:GAL4:GAL4转录因子的分子机理转录因子的分子机理在在GAL4 basedGAL4 based双杂交系统中双杂交系统中:正常情况在酵母细胞内正常情况在酵母细胞内:Promotergal metabolic geneGAL UASTranscriptionADBDReporter GeneGAL4 AD酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍13136/6/20236/6/2023基本原理基本原理:三个启动子，四个报告基因三个启动子，四个报告基因获得阳性克隆子获得阳性克隆子获得阳性克隆子获得阳性克隆子报告基因表达报告基因表达AbAAbA抗性筛选抗性筛选AdeAde营养筛选营

10、养筛选HisHis营养筛选营养筛选X-a-galX-a-gal蓝白筛选蓝白筛选M1G1G2降低假阳性！降低假阳性！酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍14146/6/20236/6/2023主要内容主要内容酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的基本原理酵母双杂交的基本原理ClontechClontech酵母双杂交系统酵母双杂交系统常见问题分析常见问题分析酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍15156/6/20236/6/2023Clontech MMClontech MM系统的优点系统的优点SMARTSMART方法与同源重组同源重组技术结合构建文库，聪明的酵母自己

11、做克隆。AbAAbA抗性筛选的添加，有效抑制背景生长，大大降低假阳性。文库构建于型酵母菌株型Y187中，方便后续与a型菌株Y2H Gold进行matingmating直接筛选。酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍16166/6/20236/6/2023Clontech MMClontech MM系统系统:蛋白互作基本流程蛋白互作基本流程验证蛋白互作验证蛋白互作自己构建文库：自己构建文库：630490630490预制细菌文库：预制细菌文库：638802638802（传统型）（传统型）预制酵母菌文库：预制酵母菌文库：630480630480（均一化，通用型）（均一化，通用型）Clontec

12、hClontech蛋白互作相关试剂盒蛋白互作相关试剂盒文库筛选文库筛选文库构建文库构建酵母双杂交系统：酵母双杂交系统：630489630489酵母菌转化试剂盒：酵母菌转化试剂盒：630439630439酵母培养基（套装）：酵母培养基（套装）：630495630495插入片段检测：插入片段检测：630497630497酵母质粒提取：酵母质粒提取：630467630467体内验证：体内验证：630489630489630305630305体外体外Co-IPCo-IP验证：验证：630458630458630459630459631723631723631604631604酵母双杂交系统技术介绍酵母

13、双杂交系统技术介绍17176/6/20236/6/2023文库构建文库构建:Clontech MM:Clontech MM文库构建方法文库构建方法 SMARTSMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培养，收集菌液 文库分装，冻存文库分装，冻存1ml mating1ml matingAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGLD-PCRLD-PCRCCCC

14、CCAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTGGG酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍18186/6/20236/6/2023 SMARTSMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培养，收集菌液 文库分装，冻存文库分装，冻存1ml mating1ml mating自己自己做克隆做克隆SD/LEU-SD/LEU-Y187Y187同源重组同源重组SMART SMART c cDNA DNA 两两小小时时构构建建文文库库文库构建文库构建:Clontech MM:Clontech MM文库构建方法文库构建方法酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂

15、交系统技术介绍19196/6/20236/6/2023 SMARTSMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培养，收集菌液 文库分装，冻存文库分装，冻存1ml mating1ml matingSD/LEU-SD/LEU-文库构建文库构建:Clontech MM:Clontech MM文库构建方法文库构建方法酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍20206/6/20236/6/2023文库构建文库构建:Clontech MM:Clontech MM自制文库筛选自制文库筛选 SMARTSMART合成合成cDNAcDNA共转化，涂板共转化，涂板 培养，收集菌液培

16、养，收集菌液 文库分装，冻存文库分装，冻存1ml mating1ml matingY187Y187，A AD D 文库文库Y2Y2H GOLDH GOLD，BDBD诱饵培养液诱饵培养液DDO/X/ADDO/X/ADDO/X/ADDO/X/A混合混合混合混合Q QQ QDO/X/ADO/X/ADO/X/ADO/X/A酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍21216/6/20236/6/2023文库筛选文库筛选:Clontech MM:Clontech MM文库筛选文库筛选630489 630489 Matchmaker Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid Sy

17、stemGold Yeast Two-Hybrid System630489630489Y187Y187Y2H GoldY2H Gold三个载体三个载体阳性对照，阳性对照，阴性对照。阴性对照。BD vectorBD vector：pGBKT7pGBKT7AD vector:pGADT7AD vector:pGADT7630439630439极大提高转化率极大提高转化率可以单独购买可以单独购买酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍22226/6/20236/6/2023文库筛选文库筛选:Clontech MM:Clontech MM 系统质粒系统质粒诱饵载体诱饵载体In Y2H GoldI

18、n Y2H Gold酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍23236/6/20236/6/2023文库筛选文库筛选:诱饵载体构建及其自激活检测诱饵载体构建及其自激活检测Y2Y2H GOLDH GOLD诱饵载体诱饵载体SD-Trp/X/A酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍24246/6/20236/6/2023文库筛选文库筛选:Mating:Mating方法筛选方法筛选Y187Y187Y187Y187 型型型型DDODDODDODDO筛选筛选筛选筛选二倍体二倍体二倍体二倍体Y2H GoldY2H GoldY2H GoldY2H Golda a a a 型型型型Mating Mat

19、ing 接合反应接合反应 酵母的有性生殖过程，酵母的有性生殖过程，ClontechClontech利用这个过程，实现了文库筛选。利用这个过程，实现了文库筛选。AD AD BD BD MixMixMixMixMatingMatingMatingMatingQDOQDOQDOQDO筛选筛选筛选筛选酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍25256/6/20236/6/2023文库筛选文库筛选:均一化通用文库筛选均一化通用文库筛选均一化通用型文库均一化通用型文库高丰度与低丰度均衡高丰度与低丰度均衡大大降低工作量大大降低工作量大大降低假阳性大大降低假阳性更高的基因代表性更高的基因代表性Normal

20、izedUniversalPre.libraryY187Y187，A AD D 文库文库Y2Y2H GOLDH GOLD，BDBD诱饵培养液诱饵培养液DDO/X/ADDO/X/ADDO/X/ADDO/X/A混合混合混合混合Q QQ QDO/X/ADO/X/ADO/X/ADO/X/A酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍26266/6/20236/6/2023文库筛选文库筛选:传统细菌文库筛选传统细菌文库筛选文库培养文库培养提取质粒提取质粒转化酵母菌转化酵母菌 取1ml菌液按照一定比例用LB稀释，150ul/板进行涂板，过夜培养。将提取的质粒转化Y187，获得酵母文库。MatingMati

21、ng筛选筛选将文库与诱饵培养液混合，进行Mating。涂筛选板，挑取阳性克隆子。刮取平板上的菌落，提取质粒。酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍27276/6/20236/6/2023文库筛选文库筛选:验证阳性克隆子（验证阳性克隆子（PCRPCR确认）确认）25ul 2mix30 PCR30 PCRcyclescycles25ul H2O630497 630497 Matchmaker Matchmaker Insert Check PCR Mix2Insert Check PCR Mix2酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍28286/6/20236/6/2023文库筛选文库

22、筛选:酵母质粒提取酵母质粒提取630467 630467 E Easy yeast Plasmid Isolation Kit asy yeast Plasmid Isolation Kit 酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍29296/6/20236/6/2023验证互作验证互作:体内验证体内验证SEAPSEAP630305 630305 Mammalian Mammalian Matchmaker Matchmaker Two-Two-Hybrid Assay Kit 2Hybrid Assay Kit 2酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍30306/6/20236/6

23、/2023验证互作验证互作:体外体外Co-IPCo-IP验证验证BaitAcGFP1AcGFP1PLPLPreyPreyProtein A/GAgarose beadsMatchmaker Chemiluminescent Co-IP Vector SetMatchmaker Chemiluminescent Co-IP Vector Set（630458630458）Matchmaker Chemiluminescent Co-IP KitMatchmaker Chemiluminescent Co-IP Kit（630459630459）Prolabel Chemiluminescent

24、Detection Kit Prolabel Chemiluminescent Detection Kit（631723631723）酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍31316/6/20236/6/2023验证互作验证互作:体外体外Co-IPCo-IP验证实验流程验证实验流程PLPL检测检测酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍32326/6/20236/6/2023验证互作验证互作:FRET:FRET分析分析632466 632466 pDsRedpDsRed-Monomer-C1 Vector-Monomer-C1 Vector632470 632470 pAcGFP1p

25、AcGFP1-C1-Vector-C1-Vector酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍33336/6/20236/6/2023Clontech MatchmakerClontech Matchmaker系统产品选择指南系统产品选择指南酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍34346/6/20236/6/20231.1.The FRIGIDA Complex Activates Transcription of FLC,a Strong Flowering Repressor in Arabidopsis,by Recruiting The FRIGIDA Complex Act

26、ivates Transcription of FLC,a Strong Flowering Repressor in Arabidopsis,by Recruiting Chromatin Modification FactorsChromatin Modification Factors K Choi,J Kim,HJ Hwang,S Kim-The Plant Cell,2011-Am Soc Plant Biol 2.2.Extracellular signal-regulated kinase 8(Erk8)controls estrogen-related receptor Ext

27、racellular signal-regulated kinase 8(Erk8)controls estrogen-related receptor (ERRERR)cellular localization and inhibits its cellular localization and inhibits its transcriptional activitytranscriptional activity M Rossi,D Colecchia,C Iavarone,A Strambi-Journal of Biological,2011 ASBMB3.3.WSB-1,a nov

28、el IL-21 receptor binding molecule,enhances the maturation of IL-21 receptorWSB-1,a novel IL-21 receptor binding molecule,enhances the maturation of IL-21 receptor H Nara,T Onoda,M Rahman,A Araki-Cellular,2011 Elsevier4.4.FHL1 interacts with oestrogen receptors and regulates breast cancer cell growt

29、hFHL1 interacts with oestrogen receptors and regulates breast cancer cell growth L Ding,C Niu,Y Zheng,Z Xiong-Journal of Cellular,2011-Wiley Online Library5.5.Rab4 interacts with the human Pglycoprotein and modulates its surface expression in multidrug resistant K562Rab4 interacts with the human Pgl

30、ycoprotein and modulates its surface expression in multidrug resistant K562 cells cells C FerrndizHuertas-Journal of Cancer,2011-Wiley Online Library6.Duplicated C-class MADS-box genes reveal distinct roles in gynostemium development in Cymbidium ensifolium 6.Duplicated C-class MADS-box genes reveal

31、 distinct roles in gynostemium development in Cymbidium ensifolium(Orchidaceae)(Orchidaceae)SY Wang,PF Lee,YI Lee,YY Hsiao-Plant and Cell,2011-Jpn Soc Plant Physiol7.7.Protein Interaction Domain Mapping of Human Kinetochore Protein Blinkin Reveals a Consensus Motif for Binding of Protein Interaction

32、 Domain Mapping of Human Kinetochore Protein Blinkin Reveals a Consensus Motif for Binding of Spindle Assembly Checkpoint Proteins Bub1 and BubR1Spindle Assembly Checkpoint Proteins Bub1 and BubR1 T Kiyomitsu,H Murakami-Molecular and Cellular,2011-Am Soc Microbiol Clontech MatchmakerClontech Matchma

33、ker系统近期参考文献系统近期参考文献酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍35356/6/20236/6/2023主要内容主要内容酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的背景介绍酵母双杂交的基本原理酵母双杂交的基本原理Clontech Clontech 酵母双杂交系统酵母双杂交系统常见问题分析常见问题分析酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍36366/6/20236/6/2023常见问题分析常见问题分析:酵母双杂交文库如何获得？酵母双杂交文库如何获得？购买购买ClontechClontech公司公司预制文库预制文库用用630490630490自己自己构建文库构建文库请请TakaraTa

34、kara公司公司提供提供文库构建服务文库构建服务如何获得酵母双杂交文库如何获得酵母双杂交文库酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍37376/6/20236/6/2023常见问题分析常见问题分析:一定要做自激活检测吗？一定要做自激活检测吗？必须滴！自激活检测必须做：自激活检测必须做：1.需要在Y2H GoldY2H Gold菌株中进行。2.如果出现自激活现象需要调整AbAAbA浓度或者调整序列序列。3.如果菌落生长过慢，可能是表达有毒性，需要用低拷贝质粒pGBT9pGBT9(630490提供)。酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍38386/6/20236/6/2023常见问题分

35、析常见问题分析:诱饵的大小有限制吗？诱饵的大小有限制吗？我们有文献报道的我们有文献报道的8-7508-750个氨基酸都有成功的案例。个氨基酸都有成功的案例。1.Heery,D.M.et al.(1997)Nature 387387(6634):733736.2.Schaefer B.C.,Ed.(1997)Gene Cloningand Analysis:Current Innovations,(Horizon Scientific Press),pp 1128.酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍39396/6/20236/6/2023常见问题分析常见问题分析:培养基较软或发黑？培养基较软或发黑？灭菌条件灭菌条件灭菌条件灭菌条件控制控制控制控制调整调整调整调整pHpHpHpH购买购买购买购买方便包装方便包装方便包装方便包装让培养基正常起来让培养基正常起来酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍40406/6/20236/6/2023：800-810-6261800-810-6261；010-80720985010-80720985 /8686： ： 我们就在这里等您我们就在这里等您酵母双杂交系统技术介绍酵母双杂交系统技术介绍41416/6/20236/6/2023Thank You Thank You！