实验一二重组质粒DNA提取、双酶切鉴定、凝胶电泳、紫外分光法.ppt

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1、质粒质粒DNA的提取、纯化、酶切、的提取、纯化、酶切、电泳、电泳、紫外分光光度法定量测紫外分光光度法定量测定定朱文博朱文博中山医学院中山医学院v基因克隆示意图基因克隆示意图分、切分、切接接转转筛筛基因工程基因工程v定义：定义：实现基因克隆所采用的方法及相关的工实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组作统称为重组DNA技术，又称重组技术，又称重组DNA技术。技术。基因载体基因载体基因工程中常用的载体基因工程中常用的载体(vector)vector)主要包括主要包括质粒质粒质粒质粒(plasmid)plasmid)、噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体(phage)phage)和和病毒病毒病毒病毒(vi

2、rus)virus)柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒柯斯质粒。这些载体均需经人工构建，除去致。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。实验内容2.2.限制性内切酶的酶切鉴定限制性内切酶的酶切鉴定(P83)(P83)3.3.定性鉴定定性鉴定:DNA:DNA的琼脂糖凝胶电的琼脂糖凝胶电泳泳(P28)(P28)4.4.定量检测：定量检测：DNADNA的紫外分光光度法的紫外分光光度法测定测定(P37)(P37)1.1.质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化(P70

3、(P70碱法碱法)实验目的实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用作用;掌握掌握核酸内切酶切割核酸内切酶切割质粒的原理并质粒的原理并学会运用内切学会运用内切酶酶掌握掌握DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的原理和步骤；的琼脂糖凝胶电泳的原理和步骤；掌握紫外分光光度计对掌握紫外分光光度计对DNADNA含量的测定方法含量的测定方法。一一.质粒质粒DNA的提取的提取1 1 关于质粒的概念关于质粒的概念a.a.什么是质粒（什么是质粒（plasmidplasmid）？）？b.b.质粒的本质是什么？质粒的本质是什么？c.c.质粒有哪些构型？质粒有哪些构型？c

4、.c.质粒有哪些特点？质粒有哪些特点？d.d.质粒的用途有哪些？质粒的用途有哪些？71.1 1.1 质粒的定义质粒的定义 质粒是细菌细胞内一种自我复制的质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链环状双链DNADNA分分子子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。不整合到宿主染色体上。在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。8(1)(1)超螺旋超螺旋DNA(supercoiledDNA,SCDNA)1.2 1.2 质粒的三种构型质粒的三种构型9(2)(2)开环开环DNA(open

5、circularDNA,OCDNA)如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。10(3)线状线状DNA(linearDNA,LDNA):如果两条链均断开，即为线状如果两条链均断开，即为线状DNADNA。电泳时，三者泳动速度大小关系（？）电泳时，三者泳动速度大小关系（？）11最快中最慢1.3 1.3 质粒质粒DNADNA的一般特性：的一般特性：(1)质粒是细菌内的共生型遗传因子质粒是细菌内的共生型遗传因子,有有相对独立性相对独立性。(2)它能在细菌中垂直遗传并

6、赋予宿主细胞一些它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型表型：菌毛、抗药性等菌毛、抗药性等(3)它是它是双链闭合环状双链闭合环状DNA，分子量大小不等。，分子量大小不等。(4)质粒质粒DNA与宿主菌染色体与宿主菌染色体DNA的两点不同：的两点不同：宿主菌染色体宿主菌染色体DNA通常比质粒通常比质粒DNA要大得多要大得多纯化分离的宿主菌纯化分离的宿主菌DNA多为线性分子，而质粒多为线性分子，而质粒DNA呈闭合环的形式。呈闭合环的形式。131.4 1.4 提取质粒提取质粒DNADNA的目的与意义：的目的与意义：基因载体基因载体/基因克隆基因克隆/基因工程基因工程2.1 2.1 提取质粒提取质粒D

7、NADNA的常规方法的常规方法 (1)SDS (1)SDS碱裂解法碱裂解法 (2)(2)煮沸法煮沸法 (3)high pure plasmid isolation kit等。等。但原理相似，都是利用宿主染色体但原理相似，都是利用宿主染色体DNADNA和质粒和质粒DNADNA的差异来分离的。的差异来分离的。2 2 提取大肠杆菌质粒提取大肠杆菌质粒DNADNA的的方法和原则方法和原则2.2 2.2 分离纯化质粒分离纯化质粒DNADNA的主要步骤的主要步骤(1)(1)培养细菌使质粒扩增（培养细菌使质粒扩增（DNADNA的扩增与选择）的扩增与选择）(2)(2)细菌的收集与裂解细菌的收集与裂解 收集方法

8、：高速离心的方法收集方法：高速离心的方法 裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、裂解细菌方法：去污剂法、有机溶剂法、碱变性法碱变性法碱变性法碱变性法、沸水沸水沸水沸水 热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。热裂法、溶菌酶法、超声处理法等。根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的根据质粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的 纯化方法等因素综合后加以选择。纯化方法等因素综合后加以选择。纯化方法等因素综合后加以选择

9、。纯化方法等因素综合后加以选择。(3)(3)质粒质粒DNADNA的纯化的纯化 常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等常用的方法有：超速离心、层析法、聚乙二醇沉淀法等 所有纯化方法都是利用了质粒所有纯化方法都是利用了质粒所有纯化方法都是利用了质粒所有纯化方法都是利用了质粒DNADNADNADNA相对较相对较相对较相对较 小及共价闭合环状的性质。小及共价闭合环状的性质。小及共价闭合环状的性质。小及共价闭合环状的性质。2.3 2.3 核酸分离纯化的总原则：核酸分离纯化的总原则：v(1)(1)保证

10、核酸一级结构完整保证核酸一级结构完整v (2)(2)排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、排除其他分子的污染（蛋白质、脂类、糖、糖、有机溶剂、金属离子、其他有机溶剂、金属离子、其他DNADNA、RNARNA等）等）3.SDS-3.SDS-碱裂解法提取碱裂解法提取Puc119-U6Puc119-U6重组质粒重组质粒DNADNA3.1 3.1 实验原理：实验原理：高碱高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放细菌的细胞壁破裂，内容物释放染色体染色体DNA断裂成不同长度的线性双链断裂成不同长度的线性双链DNA；线性双链线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。片段中的氢键断裂，双链解离变性。质粒质粒DNA不发

11、生断裂，保持双链闭合环状；不发生断裂，保持双链闭合环状；双链双链DNA并不完全分离。并不完全分离。高酸高酸中和中和至中至中性性变性的染色体变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物成网络状大分子不溶性沉淀物质粒质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化纯化RNA酶消化除去酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质，并用酚抽提法除去残留的蛋白质3.2 3.2 主要试剂及作用主要试剂及作用溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTAEDTA、TrisTrisHClCl组成组成.(保护、缓冲保护、缓冲)葡萄

12、糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的减少抽提过程中的机械机械剪切作用剪切作用,防止破坏质粒防止破坏质粒.(保护作用保护作用)EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止防止DNA酶对酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）质粒分子的降解作用。（保护作用）TrisHCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作范围（缓冲作用）用）19溶溶液液IIII：由由SDSSDS（十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠）与与 NaOHNaOH 组组成成(裂裂解解、变变性性)SDSSDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之的作

13、用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之 变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）NaOHNaOH（PH12PH12）的作用是破坏氢键，使）的作用是破坏氢键，使DNADNA分子变性（分子变性（DNADNA变变性作用）性作用）20溶液溶液IIIIII：HAC(HAC(乙酸乙酸)和和 KAC(KAC(乙酸钾乙酸钾)组成的高盐溶液组成的高盐溶液 (复性，分离复性，分离)HACHAC溶液溶液能中和溶液能中和溶液的碱性，使染色体的碱性，使染色体DNA DNA 变性而发生缠绕，并使质粒变性而发生缠绕，并使质粒DNADNA复性。复性。KACKAC会与会与SDSSDS形成溶解度很低的盐，并

14、与蛋白质形成形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成 沉淀而除去；溶液中的沉淀而除去；溶液中的DNADNA也会与蛋白质也会与蛋白质-SDS-SDS 复合物缠绕成大分子而与小分子质粒复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNADNA分离。分离。3 3.3 3 实实验验步步骤骤加加1.5ml1.5ml培养物于培养物于EPEP管，管，12000g12000g30S30S除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的2 200 00 l l 溶液溶液I I，剧烈振荡，剧烈振荡EPEP管，室温管，室温3min3min加入加入200200l l 溶液溶液IIII，快速颠倒数次，冰浴，快速颠倒数次，冰浴3min3min加入加入1

15、50150l l 冰冰溶液溶液IIIIII，温和振荡，温和振荡10s10s，冰浴，冰浴5min5min，12000g12000g5min5min转移上清到新转移上清到新EPEP管，加入等体积管，加入等体积酚酚/氯仿氯仿(1:1)(1:1)，温和振荡，冰浴，温和振荡，冰浴3min3min，12000g12000g5min5min上层水相转移到新上层水相转移到新EPEP管管，加入，加入2 2倍体积倍体积无水乙醇无水乙醇，颠倒混匀，颠倒混匀，-20-20 冰箱中放置冰箱中放置15min15min，12000g12000g 10min10min 弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加1ml 1ml 70%7

16、0%乙醇乙醇，12000g12000g5min 5min 去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置10min10min，20 20 l TE l TE 溶解溶解DNADNARCF=1.12r（rpm/1000)2RCF:离心力（离心力（g）r:离心半径（离心半径（mm）rpm:每分钟转速（每分钟转速（r/min）注意事项：注意事项：1、加样枪正确使用；2、标记自己所提取的质粒类型；3、废液倒在水池中，枪头扔到垃圾桶中；4、加不同溶液要换枪头；5、离心前把管擦干；6、转移上清时不要吸到沉淀；7、吸取酚时枪头伸到下层溶液中，注意不要沾到 皮肤；8、每人最终得到20ul质粒DNA，其中10ul用

17、于酶 切和电泳，其余10ul用于下次的转化实验，切 记！二、限制性内切酶切割重组质粒二、限制性内切酶切割重组质粒 1 1 关于限制性核酸内切酶关于限制性核酸内切酶 （restriction restriction endonucleaseendonuclease）1.1 1.1 定义定义 能在特异位点（酶切位点）上催化双链能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNADNA分子分子的断裂的断裂,产生相应的限制性产生相应的限制性DNADNA片段。片段。主要存在于细菌体内。主要存在于细菌体内。切割不同来源的切割不同来源的DNADNA分子将产生特征性限制性酶分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值

18、（切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀分子手术刀”）。）。251.3 1.3 作用作用 与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身保护自身DNA。1.2 1.2 分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。1.4 1.4 命名命名Hin d属属系系株株序序H

19、aemophilusinfluenzaed株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶2 2 BamHIBamHI 、HindHind酶切质粒及鉴定酶切质粒及鉴定2.1 2.1 实验原理：实验原理：利用限制性内切酶特异的识别利用限制性内切酶特异的识别DNADNA特异的特异的核苷酸序列，并切割核苷酸序列，并切割DNA,DNA,产生一定长度的产生一定长度的DNADNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒别目的基因（重组质粒DNADNA）28重组质粒重组质粒BamHIHindIII双酶切双酶切电泳检测电泳检测5-GAATTC-33

20、-CTTAAG-5BamHI5-AAGCTT-33-TTCGAA-5 HindIIIPUC119（3.2Kb）U6启动子（256bp）2.2 2.2 实验材料实验材料:(1)(1)重组质粒重组质粒;(2)(2)BamHIBamHI 、HinHind d 限制性内切酶限制性内切酶;(3)(3)反应缓冲液。反应缓冲液。312.3 2.3 实验步骤实验步骤(1)(1)建立反应体系建立反应体系(2)(2)酶切反应（温育酶切反应（温育1-2h1-2h）(3)(3)电泳鉴定电泳鉴定322.4 2.4 双酶切体系双酶切体系质粒粒DNA10l10Mbuffer2lBamH1lHind1lddH2O6l33合计

21、合计20l准备室准备室老师已老师已加好加好同学自己加同学自己加37，1-2h思考思考题题？为什么要什么要对重重组质粒粒DNA进行双行双酶切？切？341 1 原理原理 在在在在pH8.0pH8.0pH8.0pH8.0（碱性）的环境中碱性）的环境中碱性）的环境中碱性）的环境中DNADNADNADNA的磷酸基团解的磷酸基团解的磷酸基团解的磷酸基团解离，使离，使离，使离，使DNADNADNADNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极在该环境中带负电荷，在电场中向正极在该环境中带负电荷，在电场中向正极在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种方向泳动，因为各种方向泳动，因为各种方向泳动，因为各种

22、DNADNADNADNA分子的电荷数、分子量、分子的电荷数、分子量、分子的电荷数、分子量、分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。到分离的目的。到分离的目的。到分离的目的。DNADNADNADNA显显显显色色色色剂剂剂剂多多多多用用用用EBEBEBEB，它它它它能能能

23、能和和和和碱碱碱碱基基基基间间间间的的的的氢氢氢氢键键键键结结结结合合合合，在紫外光照射下呈橘红色（在紫外光照射下呈橘红色（在紫外光照射下呈橘红色（在紫外光照射下呈橘红色（530nm530nm530nm530nm）的荧光。的荧光。的荧光。的荧光。35三、酶切质粒三、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶后的琼脂糖凝胶电泳电泳1.1 1.1 影响影响DNADNA在凝胶中迁移速率的因素在凝胶中迁移速率的因素 v1 DNA分子的大小v2 构象v3 凝胶浓度v4 电压v5 缓冲液1.2 1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度琼脂糖浓度（，（，W/V)DNA分子的有效分离范围（

24、分子的有效分离范围（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-22 2 实验材料及试剂实验材料及试剂琼脂糖 电泳缓冲液：1TAE 10 加样缓冲液 EB染色液 它能和碱基间的氢键结合，在波长为它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm365nm254nm365nm的紫外光照射下呈橘的紫外光照射下呈橘红色（红色（530nm530nm）的荧光）的荧光.琼脂糖凝胶板的制备琼脂糖凝胶板的制备（封板、制备（封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）倒缓冲液，加样倒缓冲液，加样（取酶切质粒取酶切质粒DNA样品液样品液20

25、l+4l上样缓冲液，混匀上样缓冲液，混匀）电泳（电泳（100V0.5小时，小时，5V/cm）染色与检测染色与检测（EB染色染色5min，洗脱，洗脱3min，紫外灯下检测），紫外灯下检测）3 3 实验步骤实验步骤一、电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽，根据情况更换buffer排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。4.计算agarose的用量和制胶 buf

26、fer的用量记录，胶最终越薄越好。实验记录备查二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和bufferBuffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。制胶的桌面相对水平。倒胶时

27、尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显；不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。5.拔梳子，放入电泳槽。缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。三、上样电泳步骤注意事项1.样品中加入loadin

28、g buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。2.点样沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完，吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。如果是有特殊要求，例如回收，强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好，注意保证质量。点样的量不要太大，一方面是体积不要太大，溢出污染邻位样品；一方面两不要太大，容易导致脱尾和模糊不清。3.接通电源，选择合适的电压和时间电泳。胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看

29、看，防止样品跑出胶等意外发生。四、染色成像步骤注意事项1.染色如果胶中没有加入EB，用0.5ug/ml的EB溶液浸染30分钟。2.调整镜头的拍摄范围和焦距，成像3.打印照片做分析记录思考题？v酶切前后的对比？44M酶切后酶切前点点样样孔孔细细菌菌基基因因组组DNAOC型型质质粒粒DNAL型型质质粒粒DNASC质质粒粒DNA细细菌菌RNA质质粒粒电电泳泳图图谱谱四、紫外分光光度法检测四、紫外分光光度法检测DNA浓浓度度1 1 分光光度技术分光光度技术1.1 1.1 概述概述分分光光光光度度技技术术是是利利用用物物质质特特有有的的吸吸收收光光谱谱对对其其进行定性、定量分析的实验技术进行定性、定量分

30、析的实验技术。471.2 1.2 特点特点灵敏度高：测定下限可达灵敏度高：测定下限可达10105 510106 6mol/Lmol/L准确度高：能够满足微量组分的测定要求，准确度高：能够满足微量组分的测定要求，相对误差相对误差2 25 5（1 12 2）;操作简便快速操作简便快速;应用广泛。应用广泛。482.1 2.1 分光光度计的基本部件分光光度计的基本部件光光电电492 2 紫外分光光度法的原理紫外分光光度法的原理（氢灯、氘灯）（氢灯、氘灯）入射光反射光分散光吸收光透过光入射光反射光分散光吸收光透过光用溶剂作为用溶剂作为“空白空白”校正反射光、分散光校正反射光、分散光入射光（入射光（I I

31、0 0）吸收光透过光（）吸收光透过光（I It）50光吸收基本定律光吸收基本定律:Lambert-Beer:Lambert-Beer定律定律DKCL吸光度吸光度摩尔消光系数摩尔消光系数吸收物质的光径（吸收物质的光径（cm）溶液浓度（溶液浓度（mol/L）2.2 2.2 分光光度法分析的依据分光光度法分析的依据：物质对光是有选择的吸收，其吸收光谱取决于物物质对光是有选择的吸收，其吸收光谱取决于物质的结构，这就是分光光度法质的结构，这就是分光光度法定性定性分析的依据；分析的依据；其吸收光谱的强度与物质的浓度有关，这是分光其吸收光谱的强度与物质的浓度有关，这是分光光度法光度法定量定量分析的依据。分析

32、的依据。512.3 2.3 吸收池吸收池或称比色杯、比色皿、比色池，是用来盛装或称比色杯、比色皿、比色池，是用来盛装被测溶液和决定透光液层厚度的器件。被测溶液和决定透光液层厚度的器件。一般由玻璃或石英制成，一般由玻璃或石英制成，注意：注意：a.a.与光束垂直；与光束垂直；b.b.规格相同；规格相同；c.c.清洁。清洁。522.4 2.4 紫外分光光度法检测紫外分光光度法检测DNADNA的原理的原理原理：核酸分子含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，原理：核酸分子含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在在260nm处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸浓度成正比。酸浓度成正比

33、。优点：简单、快速、灵敏、样品可以回收。优点：简单、快速、灵敏、样品可以回收。缺点：有一定的误差（原因）；受蛋白类物质干扰。缺点：有一定的误差（原因）；受蛋白类物质干扰。53产生误差的原因：产生误差的原因：1.1.单色性不纯的影响；单色性不纯的影响；2.2.杂散光的影响；杂散光的影响；3.3.比色皿的影响；比色皿的影响；4.4.温度、温度、pHpH值的影响；值的影响；5.5.吸光度读数时的误差。吸光度读数时的误差。543 3 实验步骤实验步骤1.1.用用0.10.1TETE 对待测对待测DNADNA样品按样品按1:201:20稀释稀释2.2.0.10.1TETE作作为为空空对对照照,在在波波长

34、长260nm260nm、280nm280nm、310nm310nm处分别测标准处分别测标准DNADNA样品的样品的ODOD值值3.3.根据根据ODOD值计算值计算DNADNA浓度（浓度（g/mlg/ml）单链DNAssDNA=33(OD260OD310)稀释倍数双链DNAdsDNA=50(OD260OD310)稀释倍数4.DNA4.DNA的纯度鉴定的纯度鉴定 ODOD260260/OD/OD280280=1.8 =1.8 （RNARNA为为2.02.0）1.8 1.8 可能有可能有RNARNA污染污染 1.8 1.8 可能有蛋白质污染可能有蛋白质污染552006.04.062006.04.06