微生物的遗传变异和育种(9).ppt

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1、第七章微生物的遗传变异和育种第七章微生物的遗传变异和育种有 关 概 念 1 遗传性（inheritance）生物的亲代传递给其子代一套遗传信息的特性 遗传型（genotype）生物体所携带的全部基因的总称 表型(phenotype)具有一定遗传型的个体，在特定的外界环境中，通过生长和发育所表现出来的种种形态和生理特征的总和。饰度（modification)同型遗传型的生物，在不同的外界条件下，会呈现不同的表型。变异（variation)只有遗传性的改变，即生物体遗传物质结构上发生的变化，才称为变异。在群体中，自然发生变异的机率极低，但一旦发生后，却是稳定的和可遗传的。第一节遗传变异的物质基础

2、三个经典试验 经典转化试验 噬菌体感染试验 植物病毒的重建试验质 粒(plasmid)质粒（plasmid）是微生物染色体外或附加于染色体的携带有某种特异性遗传信息的DNA 分子片段。目前仅发现于原核微生物和真核微生物的酵母菌。微生物质粒DNA 与染色体DNA 差别在于：宿主细胞染色体DNA 分子量明显大于细胞所含质粒DNA 分子量，如大肠杆菌（Escherichia coli）染色体的DNA 分子为4.6103kb 左右，而通常用于基因工程中的载体一般均小于10kb，1100106Da。大肠杆菌染色体质粒DNA 较宿主细胞染色体DNA 更为耐碱性。质粒所携带的遗传信息量较少。由于质粒DNA

3、的分子量较小，因此所携带的遗传信息远较宿主细胞染色体所携带的遗传信息为小，而且各携带的遗传信息所控制的细胞生命代谢活动很不相同。一般来说，细胞染色体所携带的遗传信息控制其关系到生死存亡的初级代谢及某些次级代谢，而质粒所携带的遗传信息，一般只与宿主细胞的某些次要特性有关，而并不关系到细胞的生死存亡。质粒还具有下列特性：可转移性。即某些质粒可以细胞间的接合作用或其它途径从供体细胞向受体细胞转移。如具有抗青霉素质粒的细胞可以水平地将抗青霉素质粒转移到其它种类细胞中，而使后者获得抗青霉素特性。可整合性。在某种特定条件下，质粒DNA 可以可逆性地整合到宿主细胞染色体上，并可以重新脱离。可重组性。不同来源

4、的质粒之间，质粒与宿主细胞染色体之间的基因可以发生重组，形成新的重组质粒，从而使宿主细胞具有新的表现性状。可消除性。经某些理化因素处理如加热、或加入丫啶橙或丝裂霉素C、溴化乙锭等，质粒可以被消除，但并不影响宿主细胞的生存与生命活动，只是宿主细胞失去由质粒携带的遗传信息所控制的某些表现型性状。细菌质粒和真核生物细胞器DNA 的共同点 1、自体复制。2、一旦消失以后，后代细胞中不再出现 3、它们的DNA 只占染色体DNA 的一小部分。细菌质粒和真核生物细胞器DNA 的区别 1、成分和结构简单，一般都是较小的环状DNA 分子，并不和其他物质一起构成一些复杂的结构。2、功能更为多样化，可一般不是必需的

5、。3、许多细菌质粒能通过细胞接触而自动地从一个细菌转移到另一个细菌，使两个细菌都带有此质粒。几种代表性的细菌质粒 致育因子，是大肠杆菌等细菌中决定性别的质粒，分子量62 x 106Da，94.5kb。F 因子除在大肠杆菌等肠道细菌中存在外，还存在于假单胞菌属（Pseudomonas）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、奈瑟氏球菌属（Neisseria）和链球菌属（Streptococcus）等的细菌中。2、R 因子(Resistance factor)抗药性质粒，多数由相连的两个DNA 片段组成。其一称RTF 质粒（抗性转移因子），它含有调节DNA 复制和拷贝数的基因及转移基因，有时还有四

6、环素抗性基因（tet)。分子量为11 106Da 其二为抗性决定质粒（r-determinant)。大小不固定，其上含其他抗生素的抗性基因。R 因子由RTF 质粒和r 决定质粒结合形成。3、Col 因子(Colicinogenic factor)产大肠杆菌素因子 大肠杆菌素（colicin)是一种由大肠杆菌的某些菌株所分泌的细菌素，具有通过抑制复制、转录、转移或能量代谢等而专一地杀死其他肠道细菌的功能，其分子量约（4 x104D）（8 x104D）。大肠杆菌素都是由质粒Col 因子编码的。4、Ti 质粒（Tumor inducing plasmid)诱癌质粒，长200kb,是一大型质粒，当前已

7、成为植物遗传工程研究中的重要载体。5、巨大质粒（mega 质粒）分子量200300 x 106D，上有一系列固氮基因，存在于根瘤菌中 6、降解性质粒 在假单胞菌（Pseudomonas)等中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质作碳源。7、致瘤性质粒(tumor inducing plasmid)a.T1质粒是存在于致病菌根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中的携带有可以导致许多双子叶植物根系产生冠瘿病（crown gall tumor）根癌基因的质粒。b.Sym 质粒 是快生型根瘤菌细胞中存在的携带有某种可以识别

8、、侵染相应豆科植物根系与之形成共生根瘤的基因的质粒。（8）、杀伤性质粒 发现于真菌的酵母菌（yeast）和黑粉菌的致死颗粒（killer particles），其性能如肠杆菌素质粒。但致死颗粒的基因组都为双链RNA，不是双链DNA，且有蛋白质外壳包围，尤如双链RNA 病毒。9、已证实和可能与人类疾病有关的质粒 在较少致病性的霍乱弧菌（Vibrio cholera）的菌株中存在有质粒P（性因子，促进接合作用）和V（功能未知），而具有强力致病性的菌株中则没有这样的质粒。质粒P 和V 被认为其产物可干扰肠毒素的生物合成和膜运输而减少引起霍乱的可能性。致病的产气荚膜梭菌型C（Clostridium p

9、erfringens Type C）和引起牙齲的链球菌的突变株都含有质粒，前者的质粒可控制肠毒素的合成，后者的质粒可控制合成不溶性胞外多糖。10、酵母菌中的2m 质粒和其他质粒 存在于真核微生物酵母菌细胞核中但独立于染色体内的长度为2m 并与组蛋白相结合的DNA 质粒。酵母菌中还存在其他如编码细菌性纤维素酶的质粒。第二节基因突变和诱变育种 一、基因突变 突变(mutation)指遗传物质 核酸（DNA 或RNA 病毒中的RNA）中的核苷酸顺序突然产生了稳定的可遗传的变化。包括基因突变(gene mutation)和染色体畸变(chromosomal aberration)两类 基因突变是由于D

10、NA 链上的一对或少数几对碱基发生改变而引起的。染色体畸变则是DNA 的大段变化（损伤）现象，表现为染色体的添加（插入、缺失、重复、易位和倒位）突变类型 依据表型改变分为：1、形态突变型 发生细胞形态变化或引起菌落形态改变的突变型。2、生化突变型 一类发生代谢途径变异但无明显形态变化的突变型。3、致死突变型 造成个体死亡或生活力下降的突变型，后者称为半致死突变型。4、条件致死突变型 在某一条件下具致死效应，而在另一条件下无致死效应的突变型DNA 的修复 1、光复活（Photoreactivation)2、切除修复(Excision repair)3、重组修复(Recombination rep

11、air)4、SOS 修复二、突变与育种 1）从生产中选育 在日常生产中微生物会以一定频率发生自发突变。此时可以抓住良机选育优良的生产菌种。（2）定向培养优良菌种 定向培育一般是指用某一特定环境长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进行移种传代，是达到积累和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。培育新种的过程十分缓慢。诱变育种 利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后简便、快速和高效地筛选少数符合育种目的的突变株。营养缺陷型筛选的四个环节 诱变剂处理 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型 第三节基因重组和杂交育种 一、原核生物的基因育种 1、转化（Tra

12、nsformation)2、转导(Transduction)3、接合(Conjugation)4、原生质体融合 1、转化（Transformation)受体菌接受供体菌的 DNA 片段，经过交换将它组合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象，称为转化。转化后的受体菌称转化子（Transformant)。供体菌 受体菌 感受态细胞 转导(Transduction)通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA 片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称转导。转导又分为:普遍性转导 局限性转导，两类。普遍性转导(Generalized transduction)噬菌体

13、可误包供体菌中的任何基因，并使受体菌实现各种性状的转导，称为普遍性转导。分两种：1）完全转导 2）流产转导普遍性转导中外源DNA 的三种后果 1)进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子.2)如果转导DNA不能进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到表达，就成为流产转导（abortive transduction），其特点是在选择培养基平板上形成微小菌落。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。3）被降解,转导失败，在选择平板上无菌落形成。完全转导(Complete transduction)在鼠伤寒沙门氏菌的完全转

14、导实验中转导媒介P22 噬菌体在野生型菌株供体菌内发育时，极少数（10-610-8）噬菌体将与噬菌体头部DNA 芯子相仿的供体菌DNA 片段误包入其中，因此形成了完全不含噬菌体本身DNA 的假噬菌体，当假噬菌体将外源DNA 片段导入营养缺陷型菌株受体菌内时，由于导入的供体DNA 片段可与受体染色体组上的同源区段配对，再通过双交换而重组到受体菌染色体上，形成了遗传性稳定的转导子。流产转导(Abortive transduction)由于转导噬菌体所引入的野生型基因并没有整合到受体菌的染色体上，因而不能复制，当受体菌分裂为两个时，只有一个细菌获得了这一基因，而另一个细菌未获得从而还是营养缺陷型细菌

15、。表现为基本培养基上除了正常大小的菌落外，还有一些微小菌落。局限转导(Restricted transduction)局限转导：通过某些部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的转导现象。据转导频率的高低分为低频转导和高频转导。局限性转导与普遍性转导的主要区别：1）被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而完全转导包装的可能全部是宿主菌的基因；2）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。接合(Conjugation)通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA 的过程，称为接合

16、。在细菌中，接合现象研究得最清楚的是大肠杆菌。发现大肠杆菌有性别分化，决定它们性别的因子称为F 因子（致育因子）。F 因 子(Fertility factor)一种在染色体外的小型独立的环状DNA，一般呈超螺旋状，具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中去的能力，此外，其中还带有一些对其生命活动关系较小的基因。F 因子的分子量为5 x 107Da。原生质体融合(Cytoplasmic fusion)通过人为方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并发生重组子的过程，称为原生质体融合或细胞融合。二、真核微生物的基因重组 1、有性杂交(Sexual Hybridization)有

17、性杂交，一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。准性杂交的类型 I 1）菌丝联结（amastomosis)：发生在形状相同而遗传性有异的同一菌种两个不同菌株间。频率极低。2）形成异核体(heterocaryon)：体细胞联结，原有的单倍体核形成了双相异核体。3）核融合(nuclear fusion)：异核体中的双核偶尔可以发生核融合，产生双倍体杂合子核。4）体细胞交换(somatic crossing-over)和单倍体化：体细胞交换即体细胞中染色体间的交换。第四节基因工程 生物工程（bioengineering），又称生物技术（biotechnology

18、），是一门迅速发展中的边缘学科，它以分子生物学、分子遗传学、微生物学、生物化学和细胞学的理论和技术为基础，结合化学工程、计算技术等现代工程技术，运用生物学的最新成就，定向地改造物种，再通过合适的生物反应器，对这类“工程菌”或“工程细胞株”进行大规模的培养，以生产大量有用的代谢产物或发挥它们独特生理功能的一门新兴技术。微生物和微生物学在遗传工程中的重要性 1、能充当基因工程供体DNA 载体的不是微生物就是微生物质粒 2、工具酶几乎都来自于微生物 3、作为基因工程中的受体基因工程主要步骤 分离或合成基因；体外重组将基因插入载体；重组DNA 导入受体细胞；基因克隆和筛选重组子；克隆的基因进行鉴定或测

19、序；外源基因的表达和基因产物或转基因微生物、转基因动物、转基因植物的获得。1、目的基因的取得 2、载体的选择 3、目的基因与载体DNA 的体外重组 4、重组载体引入受体细胞 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）或简称为限制性酶（restriction enzyme）是指能识别双链DNA 分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA 的一类内切酶.可分成三类：I 类酶结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA。III 类酶在识别位点上切割DNA 分子，然后从底物上解离。以上二类酶兼有切割和修饰（甲基化）的作用，并依赖于ATP 的存在。II 类酶由二种酶组成，

20、一种为限制性内切核酸酶，它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。至今已分离出600 多种II 类酶。DNA 连接酶 将不同的DNA 片段连接在一起的酶叫DNA 连接酶。DNA 连接酶主要来自T4 噬菌体和大肠杆菌。DNA 连接酶催化两个双链DNA 片段相邻的5 端磷酸与3 端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链DNA 中单链切口的封闭，也能催化两个双链DNA 片段进行连接。DNA 连接酶主要有两种：一种是T4 DNA 连接酶，另一种是大肠杆菌DNA 连接酶。T4DNA 连接酶由一条多肽链组成，相对分子量为6 800Da，通常催化粘性末端间的连接效率要比催化平末

21、端连接效率为高。催化反应需要Mg2+和ATP，ATP 作为反应的能量来源。T4 DNA 连接酶在基因工程操作中被广泛应用。大肠杆菌DNA 连接酶的相对分子量为7 500Da，连接反应的能量来源是NAD+，此酶催化DNA 连接反应与T4 DNA 连接酶大致相同，但不能催化DNA 分子的平端连接。体外DNA 连接方法目前常用的三种：（1）用T4 或E.coli DNA 连接酶可连接具有互补粘性末端的DNA 片段；（2）用T4 DNA 连接酶连接具有平末端DNA 片段；（3）先在DNA 片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再进行连接。微生物基因克隆载体 克隆载体（cloning vector

22、）是把一个有用的目的DNA 片段通过重组DNA 技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（vector）。作为克隆载体的基本要求：能进行独立自主复制；具有便于外源DNA 的插入和限制酶作用的单一切割位点；必须具有可供选择的遗传标记，例如具有对抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括6 大类：质粒载体；噬菌体载体；柯斯质粒载体；M13 噬菌体载体；真核细胞的克隆载体；人工染色体等。有条件作为载体的，对原核受体细胞来说，主要有细菌质粒（松弛型）和 噬菌体两类 对真核微生物受体来说，主要有SV4O 病毒 SV4O 病毒是猴体内小型环状双链

23、DNA 病毒 对植物细胞受体来说，主要是Ti 质粒基因文库与cDNA 文库的构建 利用重组DNA 技术，可将某一原核微生物或真核微生物染色体基因组的全部遗传信息贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库（genomic library）或cDNA 文库（cDNA library）之中，犹如将文献资料贮存于图书库一样，以供长期贮存和随时调取克隆基因使用。基因文库和cDNA 文库的构建 1）、基因文库的构建 所谓基因文库是指生物染色体基因组各DNA 片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA 片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息即全部DNA 序

24、列。（2）、cDNA 文库的构建 所谓cDNA 文库是指生物体全部mRNA 的cDNA 克隆总体。cDNA 文库中的每一个克隆只含一种mRNA 信息。由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但由于细胞中的mRNA 分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有15%左右基因被表达），因而若由mRNA 逆转录为cDNA，那么所构建的cDNA文库的库容量相应较基因文库小。重组体的筛选与鉴定 在构建文库之后就需要从众多的克隆中，筛选出含有目的基因的重组体，并鉴定其正确性。三种鉴定方法:（1）、重组体表型特征的鉴定（2）、重组DNA 分子结构特征的鉴定（

25、3）、外源基因表达产物的鉴定表达载体的构建 基因工程的主要目的是使外源基因能在细菌、酵母或动、植物细胞中得到高效表达，以便获得大量有益的基因表达产物或改变微生物或动、植物的遗传性状。所谓表达载体（expression vector）是指宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。也即克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增；表达载体不仅可使外源基因扩增，还可使其表达。原核生物和真核生物的表达载体有一些共同的要求，但两者的基因表达调控机制有很大不同，故需要分别采用原核生物和真核生物的调控原件来构建。基因工程的应用 工业上的应用 农业上的应用 医疗上的应用

26、环境保护中的应用 第五节菌种的衰退、复壮和保藏 菌种保藏原理 菌种保藏的基本原理是将微生物菌种保存在不利于微生物活跃生长和代谢的不良环境中，如干燥、低温、缺氧、黑暗、营养饥饿等等，使微生物代谢速率极为缓慢或处于休眠状态。而一旦恢复所保存菌种生长的正常环境和营养条件，即可获得具有高生理活性和保持原种优良性状的菌种培养物。菌种保藏的方法有多种多样，常用方法简介如下：1、培养物传代保藏法 2、低温保藏法 3、干燥保藏法常用菌种保藏方法的比较 方法 原理 适宜菌种 保藏时间特点冰箱低温（4）低温 各大类微生物 36 个月 简便 石蜡油封藏 低温、缺氧 各大类微生物 1-2年 简便 砂土保藏 干燥、无营养 产芽孢细菌、产孢子的放线菌、霉菌 1-10年 简便有效 冷冻干燥保藏干燥、低温、无氧 各大类微生物 515 年以上繁而高效 保藏菌种的活化 保藏菌种的活化是使用保藏菌种的第一步。活化的要求是使保藏菌种恢复旺盛的生命活动和显示其原有的代谢和生产性能。保藏菌种的活化必须使用保藏菌种时使用的相同培养基和培养条件，或以保藏菌种生长和代谢最佳的培养基和培养条件，以使保藏菌种能迅速恢复其原有的代谢速率和生理特性。