酶工程2中国药科大学生物工程所有.ppt

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1、酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰刘俊酶在实际应用中有局限性1、作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解；2、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，半衰期短、易变性失活；3、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求，限制了酶制剂的应用范围。一、酶分子的化学修饰概念及其作用（一级结构水平的改造）酶的化学修饰，就是在分子水平上对酶的化学结构进行改变，以达到改构和改性的目的（侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联）。达到：改造酶的作用特性（包括改变酶活性、专一性、对效应物响应性能及对辅助因子的要求）提高酶的稳定性扩大在体内应用可能性（防止在体内非专一

2、性水解、减少和消除免疫原性以利于医疗应用）化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学

3、性质。在酶结构功能研究中：1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.确定氨基酸残基的功能；3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性，尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回收。为此，有时需要通过反复试验来确定。选择修饰剂选择酶反应条件反应的专一性二、酶化学修饰的基本要求：三、酶分子化学修饰的主要方法（一）酶分子的主链修饰（二）酶分子的侧链基团修饰（三）酶分子的化学交联修饰（四）酶分子的大分子结合修饰（五）酶分子的亲和标记修饰（六）酶分子的基因修饰（七）与辅助因子相关的修饰（一）酶分子的主链修饰概念：将酶分子的主链切断或者连接，从而使酶分子的化概念：将酶分

4、子的主链切断或者连接，从而使酶分子的化学结构及其空间结构发生变化，进而改变酶的特性和功能学结构及其空间结构发生变化，进而改变酶的特性和功能的方法。的方法。1 1 主链的切断修饰主链的切断修饰通过肽酶等手段切断。比较切断前后，酶活性的变化，从通过肽酶等手段切断。比较切断前后，酶活性的变化，从而探索酶活性中心的位置及主链不同位置对酶活性的影响。而探索酶活性中心的位置及主链不同位置对酶活性的影响。2 2 主链的连接修饰主链的连接修饰通过基因融合技术将两种或两种以上的酶基因融在一起。通过基因融合技术将两种或两种以上的酶基因融在一起。（二）酶分子的侧链基团修饰（二）酶分子的侧链基团修饰概念：采用人工方法

5、使酶蛋白的氨基酸残基的侧链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。选择性修饰试剂必须要与多肽链中某种特定的氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。侧链基团修饰的主要作用1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性质和数目。2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定3.探索酶蛋白作用的化学机理4.用于酶蛋白分子的固定化（三）酶分子的化学交联修饰（三）酶分子的化学交联修饰概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可以在分子与分子之间。即酶分子的固定化。同型双亚

6、氨酯氨基双功能试剂异型碳二亚胺氨基和羧基光活化碳烯或氮烯分子内交联 增加酶分子表面交联键的数目是稳定酶的方法之一。分子间交联 用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶。（四）酶分子的大分子修饰（四）酶分子的大分子修饰概念：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。作用：（1）提高酶活力（2）增加酶的稳定性（3）降低抗原抗体反应根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。（1 1）大分子的非共价修饰）大分子的非共价

7、修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物。多元醇、多糖、多聚氨基酸、多酶的一些添加物。多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。另一类添加物就是蛋白质。（2）大分子共价修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面、形成一层覆盖层。（五）酶分子的亲和标记修饰（五）酶分子的亲和标记修饰概念：可以与酶分子的活性部位发生特异性结合，并且修饰剂的活性基团可以与酶分子的活性部位的侧链基团发生反应，形成共价键，也

8、可以称为酶分子的亲和标记。亲和试剂可以专一性地标记于酶的活性部位上，使酶不可逆失活，又称为专一性的不可逆抑制。KsKs型抑制剂：根据底物的结构设计的，具有和底型抑制剂：根据底物的结构设计的，具有和底物结构相似的结合基团，同时还具有能和活性部物结构相似的结合基团，同时还具有能和活性部位氨基酸残基侧链基团反应的活性基团，导致酶位氨基酸残基侧链基团反应的活性基团，导致酶不可逆失活。不可逆失活。KcatKcat:根据催化过程设计的，具有酶的底物性质，根据催化过程设计的，具有酶的底物性质，还有一个潜在的反应基团，在酶催化下活化后，还有一个潜在的反应基团，在酶催化下活化后，不可逆的抑制酶的活性部位。不可逆

9、的抑制酶的活性部位。KcatKcat型也称为型也称为“自自杀性抑制剂杀性抑制剂”，可以用来治疗某些疾病的药物。，可以用来治疗某些疾病的药物。（六）酶分子的基因修饰（六）酶分子的基因修饰对编码酶分子的DNA序列进行定点改变，改变酶分子的氨基酸序列（定点诱变），有目的地对酶分子的结构和功能进行改造，从而达到对酶分子进行修饰的目的。（七）与辅因子相关的修饰（七）与辅因子相关的修饰1 对依赖辅助因子的酶分子的修饰改变辅助因子与酶分子的结合方式，从而对酶进行修饰。引入新的辅助因子2 金属酶的金属取代置换酶活性中心的金属离子，提高酶的活力、增强酶的稳定性。（一）修饰酶的热稳定性四 修饰酶的性质（二）修饰酶

10、的抗原性 （三）修饰酶对各类失活因子的抵抗力（四）修饰酶在体内的半衰期 （五）最适pH （六）Km的变化五、酶蛋白化学修饰的局限性1.1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。修饰剂。2.2.化学修饰后酶的化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变构象或多或少都有一些改变，因此，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。3.3.酶的化学修饰酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进

11、行进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。4.4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需必需”的，的，为什么是必需的，还得用为什么是必需的，还得用X X射线和其他方法来确定。射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确缺

12、乏准确性和系统性。性和系统性。非水酶学非水介质中酶学基础非水介质中酶学基础水是酶促反应最常用的反应介质。水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物因为许多有机化合物(底物底物)在水介质中难溶或不溶。由于水在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。的发生。是否存在非水介质能保证酶催化？是否存在非水介质能保证酶催化？早在20世纪初，.ourquelot等曾经将乙醇、丙酮类的有机溶剂加到酶的水溶

13、液中，进行非水介质中酶催化的尝试。n1966年，Price报道胰凝乳蛋白酶和辣根过氧化物酶在几种有机溶剂中具有催化活性。非水介质酶催化发展情况19751983年间.uckland和.artinek等做了将微生物细胞、游离酶和固定化酶用于有机溶剂中合成酯和类固醇及甾醇转化的探索。19841984年，克利巴诺夫（年，克利巴诺夫（A.M.A.M.KlibanovKlibanov）等人）等人在在ScienceScience上发表上发表“Enzymatic Catalysis in Enzymatic Catalysis in Enzymatic Catalysis in Enzymatic Catal

14、ysis in Organic Media at 100Organic Media at 100Organic Media at 100Organic Media at 100”此后十几年来，酶在非水介质中催化反应的研究十分活跃。（一）气相介质中的酶催化（一）气相介质中的酶催化 酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。酶非水相催化的几种类型酶非水相催化的几种类型（二）超临界流体介质（二）超临界流体介质（supercriti

15、cal supercritical fluidsfluids）中的酶催化）中的酶催化超临界流体(Supercritical Fluid,SCF)：温度和压力超过某物质超临界点的流体。常见超临界流体系：CO2(Tc=31，Pc=7.3atm)、H2O(Tc=374，Pc=218atm)、氨、甲醇、乙醇、乙烯.对酶的结构没有破坏作用；对酶的结构没有破坏作用；对催化作用没有明显的不良影响；对催化作用没有明显的不良影响；具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；超临界温度不应太高或太低；超临界温度不应太高或太低；超临界压力不能太高；超临界压力不能太高；超临界流体容

16、易获得，价格便宜。超临界流体容易获得，价格便宜。用于酶催化反应的超临界流体应具备以下条件：用于酶催化反应的超临界流体应具备以下条件：酶在离子液离子液中进行的催化作用。离子液（离子液（ionic liquidsionic liquids）是由有机阳离子与）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈 液态的低熔点盐类液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性 和区域选择性、立体选择性、键选择性等显 著特点。（三）离子液（三）离子液（ionic liquidsionic liquids）介质）介质

17、中的酶催化中的酶催化 有机介质（有机介质（organic solvents)中的酶催化中的酶催化指酶在含有一定量水一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能发挥催化功能。酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键底物特异性、立体选择性、区域选择性、键 选择性和热稳定性选择性和热稳定性等都有所改变。（四）有机介质反应体系（四）有机介质反应体系 有机介质反应体系几种类型有机介质反应体系几种类型与水互溶的有机与水互溶的有机溶剂溶剂水单相体系水单相体系 非极性有机非极性有

18、机溶剂溶剂水两相水两相/多相体系多相体系非极性有机溶剂非极性有机溶剂酶悬浮体系酶悬浮体系(微水介质体系微水介质体系)非极性有机溶剂非极性有机溶剂-PEG-PEG修饰酶单相体系修饰酶单相体系反胶束体系反胶束体系胶束体系和反胶束体系胶束体系和反胶束体系“水包油水包油”和和“油包水油包水”表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油表面活性剂：表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。憎水的非极性基团两部分组成的两性分子。憎

19、水的非极性基团两部分组成的两性分子。在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：在有机相酶反应中用得最多的是阴离子表面活性剂：AOT(AerosolOTAOT(AerosolOTAOT(AerosolOTAOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸，其化学名为丁二酸，其化学名为丁二酸，其化学名为丁二酸-2-2-2-2-乙基酯磺酸钠。乙基酯磺酸钠。乙基酯磺酸钠。乙基酯磺酸钠。E EE EE ES S水相水相E Ep（正）胶束体系：（正）胶束体系：表面活性剂的极性段朝外，非极性端朝内，表面活性剂的极性段

20、朝外，非极性端朝内，反应时酶在胶束外面的水溶剂中，疏水性的底物或产物在胶反应时酶在胶束外面的水溶剂中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界面进行。束内部。反应在胶束的两相界面进行。p反胶束体系：反胶束体系：表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。反应时，酶分子在反胶束内部的溶液包在胶束内部。反应时，酶分子在反胶束内部的“小水小水池池”中进行催化。中进行催化。.有机相有机相S S胶束体系胶束体系反胶束体系反胶束体系水相水相有机相有机相酶在有机介质中的性质酶在有机介质中的性质 酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有

21、很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性。热稳定性热稳定性酶在有机介质中的稳定性变化酶在有机介质中的稳定性变化 储存稳定性储存稳定性酶酶 介质条件介质条件 热稳定性热稳定性猪胰脂肪酶猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯三丁酸甘油酯水，水，pH7.0pH7.0T T1/21/2 26 h 26 hT T1/21/2 2 min 2 min酵母脂肪酶酵母脂肪酶三丁酸甘油酯三丁酸甘油酯/庚醇庚醇水，水，pH7.0pH7.0T T1/21/2=1.5 h=1.5 hT T1/21/2 2 min 24 h 24 hT T1/2 1/2 10 mi

22、n 10 min限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 （Hind Hind）正庚烷，正庚烷，5555，30d30d活力不降低活力不降低 变性剂稳定性变性剂稳定性脲、盐酸胍-强变性剂破坏次级键、增加疏水性氨基酸的溶解度一般随含水量降低而增加1.11.16 60.90.9100100活力降低一半时盐酸胍浓度活力降低一半时盐酸胍浓度活力降低一半时盐酸胍浓度活力降低一半时盐酸胍浓度溶剂体系的含水量溶剂体系的含水量溶剂体系的含水量溶剂体系的含水量不同含水量盐酸胍对乳酸脱氢酶的变性作用不同含水量盐酸胍对乳酸脱氢酶的变性作用3.23.22.02.02.22.23.83.8酶在有机介质中的酶在有机介质中的底物底物

23、专一性、选择性专一性、选择性某些有机介质可能使某些酶的专一性发生变化，这是酶活性中心构象刚性增强的结果。有些在水中不能实现的反应途径，在有机介质中却成为主导反应。水溶液水溶液：疏水作用非水介质非水介质：酶和底物结合的自由能；酶和水分子结合的自由能；底物在反应介质-酶活性中心的分配。相对专一性相对专一性 对映体选择性对映体选择性（enantioselectivity）又称立体选择性，是酶在对称的外消旋化合又称立体选择性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。物中识别一种异构体的能力大小的指标。（酶）（酶）合成产物合成产物 溶剂溶剂 合成收率合成收率 枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白

24、酶 核糖核酸酶核糖核酸酶 甘油甘油90%50%90%50%无色杆菌蛋白酶无色杆菌蛋白酶 胰岛素胰岛素 乙醇乙醇30%80%30%80%凝血酶凝血酶 人生长素人生长素 甘油甘油80%20%80%20%反应平衡方向的移动反应平衡方向的移动有机介质能改变某些酶催化的反应平衡。有机介质能改变某些酶催化的反应平衡。例如：水解酶类（蛋白水解酶）例如：水解酶类（蛋白水解酶）在水介质中，水的浓度为在水介质中，水的浓度为55.5mol/L55.5mol/L，平衡趋向水解方向，平衡趋向水解方向，在含水量极低的有机介质中，平衡向合成方向偏移。在含水量极低的有机介质中，平衡向合成方向偏移。有机介质酶催化反应的影响因素

25、有机介质酶催化反应的影响因素水对有机介质中酶催化反应的影响水对有机介质中酶催化反应的影响有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。必需水必需水（essential wateressential water）：维持酶分子完整的空间构）：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量。象所必需的最低水量。例如：凝乳蛋白酶，只需分子的水。例如：凝乳蛋白酶，只需分子的水。多酚氧化酶，需个水分子。多酚氧化酶，需个水分子。胰脂肪酶活性与含水量的关系反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，

26、苯，吡啶，季丁醇，常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较好地保持其完整的空间结构。在有机溶剂中，酶分子好地保持其完整的空间结构。在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。根根根根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空间结构完整

27、性的情况也有所差别间结构完整性的情况也有所差别间结构完整性的情况也有所差别间结构完整性的情况也有所差别。手性药物的拆分有机介质中酶催化的应用有机介质中酶催化的应用手性药物两种对映体的药理作用手性药物两种对映体的药理作用 药物名称药物名称药物名称药物名称有效对映体的作用有效对映体的作用有效对映体的作用有效对映体的作用另一种对映体的作另一种对映体的作另一种对映体的作另一种对映体的作用用用用心得安（心得安（PropranololPropranolol）萘普生（萘普生（NeproxenNeproxen）青霉素胺（青霉素胺（PenicillaminePenicillamine）羟基苯哌嗪羟基苯哌嗪(Dr

28、opropizineDropropizine)反应停（反应停（ThalidomideThalidomide）酮基布洛芬（酮基布洛芬（KetoprofenKetoprofen）喘速宁（喘速宁（TrtoquinolTrtoquinol）乙胺丁醇（乙胺丁醇（EthambutolEthambutol）萘必洛尔（萘必洛尔（KebivololKebivolol）S S构型，治疗心脏病构型，治疗心脏病,-,-受体受体阻断剂阻断剂S S构型，消炎、解热、镇痛构型，消炎、解热、镇痛S S构型，抗关节炎构型，抗关节炎S S构型，镇咳构型，镇咳S S构型，镇静剂构型，镇静剂S S构型，消炎构型，消炎S S构型，扩张

29、支气管构型，扩张支气管S,SS,S构型，抗结核病构型，抗结核病右旋体，治疗高血压右旋体，治疗高血压,-,-受体受体阻断剂阻断剂R R构型，构型，钠通道阻滞剂钠通道阻滞剂R R构型，疗效很弱构型，疗效很弱R R构型，突变剂构型，突变剂R R构型，有神经毒性构型，有神经毒性R R构型，致畸胎构型，致畸胎R R构型，防治牙周病构型，防治牙周病R R构型，抑制血小板凝构型，抑制血小板凝集集R,RR,R构型，致失明构型，致失明左旋体，舒张血管左旋体，舒张血管沙利多胺沙利多胺 (Thalidomide)*酶分子定向进化酶分子定向进化Directed evolution Directed evolution

30、 enzymeenzyme酶分子定向进化酶分子定向进化酶分子定向进化酶分子定向进化酶分子定向进化酶分子定向进化模拟自然进化过程（模拟自然进化过程（模拟自然进化过程（模拟自然进化过程（随机突变随机突变随机突变随机突变和和和和自然选择自然选择自然选择自然选择）在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良

31、在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。催化特性的酶的突变体的技术过程。催化特性的酶的突变体的技术过程。催化特性的酶的突变体的技术过程。酶的定向进化酶的定向进化酶分子的合理设计酶分子的合理设计(rational design)(rational design)酶分子的定向进化酶分子的定向进化(directed evolution(directed evolution)酶的合理酶的合理设计设计基因直接进化的步骤基因直接进化的步骤突变突变 基因突变库的建立基因突变库的建立筛选筛选 基因突变库的活体或离体筛选基因突变库的活体或离体筛选基因复制与遗传基因复制与遗

32、传酶基因的体外随机突变酶基因的体外随机突变易错易错PCRPCR 定义：定义：定义：定义：从从从从单一基因单一基因单一基因单一基因出发，通过改变出发，通过改变出发，通过改变出发，通过改变PCRPCRPCRPCR反应条件，反应条件，反应条件，反应条件，在基因扩增过程中使在基因扩增过程中使在基因扩增过程中使在基因扩增过程中使碱基配对出现错误碱基配对出现错误碱基配对出现错误碱基配对出现错误而引起基因而引起基因而引起基因而引起基因突变。突变。突变。突变。过程：过程：过程：过程：双链双链双链双链DNADNADNADNA变性（解链；变性（解链；变性（解链；变性（解链；8585858595959595）引物与

33、单链引物与单链引物与单链引物与单链DNADNADNADNA结合（退火；结合（退火；结合（退火；结合（退火；5050505070 70 70 70）引物延伸（半保留复制；引物延伸（半保留复制；引物延伸（半保留复制；引物延伸（半保留复制；7070707075 75 75 75）条件：条件：条件：条件：增加增加增加增加MgMgMgMg2 2 2 2（稳定非互补的碱基对）（稳定非互补的碱基对）（稳定非互补的碱基对）（稳定非互补的碱基对）添加添加添加添加MnMnMnMn2 2 2 2（降低聚合酶的特异性）（降低聚合酶的特异性）（降低聚合酶的特异性）（降低聚合酶的特异性）4 4 4 4种底物的浓度不平衡种

34、底物的浓度不平衡种底物的浓度不平衡种底物的浓度不平衡（dATP/dTTP/dCTP/dGTPdATP/dTTP/dCTP/dGTPdATP/dTTP/dCTP/dGTPdATP/dTTP/dCTP/dGTP)定向进化的原理定向进化的原理在待进化酶基因在待进化酶基因在待进化酶基因在待进化酶基因的的的的PCRPCRPCRPCR扩增反应中，利用扩增反应中，利用扩增反应中，利用扩增反应中，利用TaqTaqTaqTaq DNA DNA DNA DNA聚合聚合聚合聚合酶不具有酶不具有酶不具有酶不具有3 3 3 35 5 5 5校对功能的性质，配合适当条件，校对功能的性质，配合适当条件，校对功能的性质，配合

35、适当条件，校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变文库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶文库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶文库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶文库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质或蛋白质或蛋白质或蛋白质)，从而排除其他突变体。，从而排除其他突变体。，从而排除其他突变体。，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是定向进化的基本规则是定向进化的基本规则是定向进化

36、的基本规则是“获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体”。定向进化定向进化定向进化定向进化=随机突变随机突变随机突变随机突变+定向选择定向选择定向选择定向选择。前者是人为引发的，。前者是人为引发的，。前者是人为引发的，。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，

37、着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。整个进化过程完全是在人为控制下进行的。整个进化过程完全是在人为控制下进行的。整个进化过程完全是在人为控制下进行的。DNADNA重排重排 定义：定义：定义：定义：又称为又称为又称为又称为DNADNADNADNA改组技术，是从改组技术，是从改组技术，是从改组技术，是从2 2 2 2种以上同源正突变种以上同源正突变种以上同源正突变种以上同源正突变基因基因基因基因出发，用酶（出发，用酶（出发，用酶（出发，用酶（DNaseIDNaseIDNaseIDNaseI）切割成随机片段，经过不加）切割成随机片段，经过不加）切割成随

38、机片段，经过不加）切割成随机片段，经过不加引物的多次引物的多次引物的多次引物的多次PCRPCRPCRPCR循环，使循环，使循环，使循环，使DNADNADNADNA的碱基序列重新排布的碱基序列重新排布的碱基序列重新排布的碱基序列重新排布而引起而引起而引起而引起基因突变的技术过程。基因突变的技术过程。基因突变的技术过程。基因突变的技术过程。原理：原理：原理：原理：DNADNADNADNA片段互为模板和引物，进行扩增和延伸时片段互为模板和引物，进行扩增和延伸时片段互为模板和引物，进行扩增和延伸时片段互为模板和引物，进行扩增和延伸时碱基序列会重新排布而形成众多的突变基因，分离出全碱基序列会重新排布而形

39、成众多的突变基因，分离出全碱基序列会重新排布而形成众多的突变基因，分离出全碱基序列会重新排布而形成众多的突变基因，分离出全长突变基因后再进行常规长突变基因后再进行常规长突变基因后再进行常规长突变基因后再进行常规PCRPCRPCRPCR扩增以进行定向选择。扩增以进行定向选择。扩增以进行定向选择。扩增以进行定向选择。结果：结果：结果：结果：将存在于不同基因中的多种正突变结合在一起。将存在于不同基因中的多种正突变结合在一起。将存在于不同基因中的多种正突变结合在一起。将存在于不同基因中的多种正突变结合在一起。1994年，年，Stemmer等，用等，用DNA Shuffling技术体外快速进化蛋白技术体

40、外快速进化蛋白有性有性PCR法法1997年年，France Aronld研究组将研究组将DNA Shuffling技术做了改进技术做了改进交错延交错延伸法伸法DNADNA重组装原理图重组装原理图(DNA shuffling)(DNA shuffling)1.1.DNaseIDNaseI产生随机片段；产生随机片段；2.2.随机片段变性；随机片段变性；3.3.随机片段复性；随机片段复性；4.4.延伸延伸 反复重复反复重复2-42-4步后，可获得全长步后，可获得全长DNADNA片段片段 交错延伸PCR突变法随机引物PCR和重组装部分部分DNA ShufflingDNA Shuffling技术的研究成

41、果技术的研究成果类类 型型示示 例例特特 性性活性增加倍数活性增加倍数潜在应用领域潜在应用领域蛋蛋 白白绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白荧光强度荧光强度4545基础研究基础研究重组蛋白重组蛋白RecARecA重组率重组率100100基础研究基础研究抗抗 体体人源抗体人源抗体亲和性亲和性400400生物制药生物制药酶酶天冬氨酸转氨酶天冬氨酸转氨酶催化特异性催化特异性1010，000000生物制药生物制药-内酰胺酶内酰胺酶抗生素抗性抗生素抗性3232，000000抗生素抗生素枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E E耐热性耐热性6565耐热时间耐热时间1717200200工业酶工业酶细胞因细胞因子子人类干扰素人类

42、干扰素抗病毒抗病毒285285，000000基因治疗基因治疗肿瘤抑制因子肿瘤抑制因子P53P533737半衰期半衰期1212基因治疗基因治疗代谢途代谢途径径砷酸盐代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒砷酸盐解毒4040生物制药生物制药汞代谢途径汞代谢途径汞解毒汞解毒1212生物制药生物制药非同源改组二、酶突变基因的定向选择二、酶突变基因的定向选择定义：定义：定义：定义：是在人工控制条件的特殊环境下，是在人工控制条件的特殊环境下，是在人工控制条件的特殊环境下，是在人工控制条件的特殊环境下，按照人们所按照人们所按照人们所按照人们所设定的进化方向设定的进化方向设定的进化方向设定的进化方向对突变基因进行选择

43、，以获得具有优对突变基因进行选择，以获得具有优对突变基因进行选择，以获得具有优对突变基因进行选择，以获得具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。良催化特性的酶的突变体的技术过程。良催化特性的酶的突变体的技术过程。良催化特性的酶的突变体的技术过程。过程：过程：过程：过程：突变基因与适宜的载体进行突变基因与适宜的载体进行突变基因与适宜的载体进行突变基因与适宜的载体进行重组重组重组重组 组装组装组装组装形成突变基因文库（细胞或噬菌体）形成突变基因文库（细胞或噬菌体）形成突变基因文库（细胞或噬菌体）形成突变基因文库（细胞或噬菌体）通过高通量通过高通量通过高通量通过高通量筛选筛选筛选筛选技术获得目的基因

44、技术获得目的基因技术获得目的基因技术获得目的基因 目的基因目的基因目的基因目的基因表达表达表达表达获得所需进化酶获得所需进化酶获得所需进化酶获得所需进化酶突变基因的筛选突变基因的筛选根据定向进化的目的设定定性选择的环境条件根据定向进化的目的设定定性选择的环境条件根据定向进化的目的设定定性选择的环境条件根据定向进化的目的设定定性选择的环境条件高通量筛选技术高通量筛选技术高通量筛选技术高通量筛选技术 特点：特点：特点：特点：通量大、效率高通量大、效率高通量大、效率高通量大、效率高 （短时间内简便地对大量突变进行判断）（短时间内简便地对大量突变进行判断）（短时间内简便地对大量突变进行判断）（短时间内

45、简便地对大量突变进行判断）方法：方法：方法：方法：平板筛选法平板筛选法平板筛选法平板筛选法 荧光筛选法荧光筛选法荧光筛选法荧光筛选法 噬菌体表面展示法噬菌体表面展示法噬菌体表面展示法噬菌体表面展示法 细胞表面展示法细胞表面展示法细胞表面展示法细胞表面展示法 核糖体表面展示法核糖体表面展示法核糖体表面展示法核糖体表面展示法定向进化示意图定向进化示意图随机突变随机突变+定向选择目标突变体定向选择目标突变体细菌细菌诱发突变的诱发突变的因素因素5050 0 0C C培养培养突变体库突变体库选择压力选择压力（温度）（温度）温度耐受型突温度耐受型突变体变体最适生长温度为最适生长温度为37370 0C C最

46、适生长温度提高了！最适生长温度提高了！定向进化的选择策略定向进化的选择策略1 1 1 1、定向进化中，突变具有随机性，但通过、定向进化中，突变具有随机性，但通过、定向进化中，突变具有随机性，但通过、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方选择特定方选择特定方选择特定方向的突变限定了进化趋势向的突变限定了进化趋势向的突变限定了进化趋势向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突，加之控制实验条件，限定突，加之控制实验条件，限定突，加之控制实验条件，限定突变种类，变种类，变种类，变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减降低突变率，缩小突变库的容量

47、，这不仅减降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。度。度。度。2 2 2 2、通常，、通常，、通常，、通常，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关。另有一些直观的筛选方法，如加入能产生可见光信号的另有一些直观的筛选方法，如加入能产生可见光信号的另有一些直观的筛选方法，如加入能产生可见光信号的另有一些

48、直观的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。3 3 3 3、选择合适高通量的筛选体系。、选择合适高通量的筛选体系。、选择合适高通量的筛选体系。、选择合适高通量的筛选体系。酶酶性质性质突变方法突变方法枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E E有机相活性有机相活性/稳定性稳定性易错易错PCRPCR-内酰胺酶内酰胺酶总活力总活力/底物专一性底物专一性DNADNA改组改组枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶稳定性稳定性 盒式诱变盒式诱变对硝基苯酯酶对硝基苯酯酶底物专一性底物专一性

49、/有机相活性有机相活性易错易错PCR/DNAPCR/DNA改组改组 胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性底物专一性盒式诱变盒式诱变-半乳糖苷酶半乳糖苷酶底物专一性底物专一性DNADNA改组改组绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白荧光荧光DNADNA改组改组核酶核酶底物专一性底物专一性易错易错PCR/DNAPCR/DNA改组改组天冬氨酸酶天冬氨酸酶活性与稳定性活性与稳定性随机随机/定位诱变定位诱变药物和疫苗药物和疫苗活性活性/专一性专一性/最佳表达最佳表达DNA改组三、酶分子定向进化的应用三、酶分子定向进化的应用1 1、提高酶的催化效率、提高酶的催化效率2 2、增强酶的稳定性、增强酶的稳定性枯草杆菌蛋

50、白酶E热稳定性的分子进化（HuiminHuimin Zhao Zhao等，等，19991999）3 3、改变酶的底物特异性、改变酶的底物特异性生物传感器生物传感器一、生物传感器的概念一、生物传感器的概念生物传感器生物传感器生物传感器生物传感器:使用固定化的生物分子使用固定化的生物分子(immobilized(immobilized biomoleculesbiomolecules),),与适当的化学换能器结合，用于与适当的化学换能器结合，用于快速侦测物理、化学、生物量的新型器件。快速侦测物理、化学、生物量的新型器件。将分子识别元件中的生物敏感物质与待测物发生化将分子识别元件中的生物敏感物质与待