乳酸菌菌种的分别挑选方法.docx

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1、乳酸菌菌种的分别筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。养分要求高，需要供给丰富的肽类 氨基酸 维生素。在琼脂外表或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。乳杆菌常用 MRS 琼脂作半选择培育基。当乳杆菌仅是简单区系中的局部菌类菌有 TYC 培育基、MS 培育基。M17 培育基被用作乳球菌的分别培育基。时，SL 培育基常用作为选择性培育基。对于芽孢乳杆菌常用 GYP 培育基，链球嗜酸乳杆菌属于乳杆

2、菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。乳酸片球菌细胞呈球状，直径 0.61.0m，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在 MRS 培育基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。常常参加醋酸盐，因醋酸盐能抑制局部细菌生长，对乳酸菌无害。乳酸菌在一般琼脂培育基上形成微小菌落，不易观看，所以分别时先富集培育并选择适宜的培育基。分别培育基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80 等物质，也依据，通过对生成的乳酸量进展性能鉴定。培育基中添加碳酸钙，乳酸溶解培育基中的碳酸钙形成透亮圈，作

3、为分别鉴别的一.筛选方法：乳酸菌生长生殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分别培育基一般可添加西红柿 酵母膏 油酸 吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含 CaCO3 的培育基上产生 CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。其中培育基中参加 CaCO3 的作用是：鉴别能产生酸的细菌；中和产生的酸， 以维持培育基的 PH。筛选过程：样品预处理梯度稀释至 10-6选择适宜的稀释度涂布37培育82.溴甲酚绿指示剂法：48h选择产生溶钙圈的菌落反复在 MRS 培育基上划线挑起单菌落染

4、色，经镜检确认为纯种选择革兰氏阳性单菌落试管穿刺 4冰箱保存。培育基：MRS 培育基含溴甲酚绿酒精溶液二.菌种的分别筛选筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌 落。1.培育基：1.1 麦芽汁碳酸钙培育基：麦芽汁10BX1L预先灭菌碳酸钙 5-10g/LPH自然分别用1.2 牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁 200g/L 葡萄糖10g/L 吐温 0.05%CaCO315-20g/L 溴甲酚绿 0.01%PH6.0-6.5分别用1.3 番茄汁碳酸钙培育基：酵母膏 7.5 g/L葡萄糖 10 g/L番茄汁 100mL 蛋白胨 7.5g/

5、L KH2PO4 2.0 g/L吐温 0.5 mLPH 6.0-6.5分别用1.4 葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/LPH 6.0-6.51.5 蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13- 15g/L KH2PO4 1.5- 2.0g/LMgSO40.3-0.5 g/LMnSO40.2-0.25g/LNaAC 3.0-5.0g/LPH 5.5-6.51.6 蛋白胨 0.8- 1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米浆 0.5- 1.0g/LKH2PO4 0.1- 0.3g/L MgSO40.3-0.5g/LNaC13-5g/L 葡萄糖 8

6、-10g/LPH5.5-6.5发酵或种子培育基1.7 MRS 培育基 分别培育计数用蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、 酵母膏 5.0g、 柠檬酸氢二铵 2.0g、葡萄糖 20.0g、 吐温 80 1.0mL、 乙酸钠 5.0g、 磷酸氢二钾 2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰 0.25g、琼脂 18.0g、 蒸馏水 1L,pH 6.5。分别培育基， 当 MRS 培育基冷却至 4550时,参加已灭菌的碳酸钙, 充分混匀,倒平板。1.8 BCP 培育基溴甲酚紫培育基乳糖 5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母膏 3.0g0.5溴甲酚紫 10ml 自来水 1000mlpH6.5-7.0分别用1.9

7、 BCG 牛乳养分琼脂：脱脂奶粉 10g，溶于 50ml 水中，参加 1.6溴甲酚绿酒精溶液 0.07ml，0.075Mpa 20min。另取琼脂 2.0g，溶于 50ml 水中，加酵母膏1.0g 溶解后调 pH6.5-6.8，0.1 Mpa 20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀，倒平板，37培育 24h，检查是否有杂菌。2.分别筛选：2.1 富集培育：取 1.0g1.0ml于无菌细口瓶中，参加无菌麦芽汁液体培育液于瓶口处，密闭，25-32培育 48h。假设培育基表内消灭绢丝波浪物，镜检杆状， 革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。以同样方法转接 2-3 次，接种量 3-5.2.2 菌种分别纯化：溶

8、钙圈法：富集菌液或样品适当稀释至 10-7，混菌法分别，先参加10-12ml MRS 培育基 或麦芽汁培育基，凝固后再注入 4-5ml 水琼脂培育基，制成厌氧环境，30或 37 培育 2-3 天温度低时间稍长，可消灭针头状或圆形稍扁菌落，四周形成透亮圈。挑取透亮圈大，培育基变黄的菌落， 反复划线纯化 2-3 次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于 MRS 培育基培育后保存备用。或接入液体培育基中，25-32培育 24-48h，然后穿刺于 MRS 培育基或麦芽汁碳酸钙半固体培育基中，25-32培育 48h 保存备用。2.3 性能测定：乳酸菌定性试验：不同条件下的产酸速率试验：将分别菌种

9、接种于 MRS 液体培育基中 25 37温度下培育测不同菌株不同温度的 pH。方法 1.吸取发酵液 10ml，注入空试管中，参加 10硫酸 1.0ml，在参加 2.0高锰酸钾约 1.0ml，此时乳酸转化成乙醛。取滤纸一条，在含氨的硝酸银溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管缓缓加热至沸腾，使乙醛挥发，假设管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。方法 2.纸层析法：开放剂为正丁醇：甲醇：水=80：15：5，毛细血管吸取发酵液，屡次点样于华滤纸上，1.5标准乳酸为比照，平衡2 小时后进展层析，3溴甲酚蓝显色计算 Rf 值。产酸量测定：5.0ml 发酵液于 150ml 三角瓶中，加中性蒸馏水 10-20ml，酚酞

10、指示剂 2 滴，用 0.1mol/l 氢氧化钠滴定至微红色。醋酸量g/100mL= 氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3/样品毫升数x100同时，进展单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。3.菌株鉴定：3.1 菌落形态：3.2 菌体形态：革兰氏染色观看染色镜检：杆状 阳性。3.3 乳酸菌运动性检测：半固体穿刺法3.4 生理生化：甲基红，明胶液化，需氧，精氨酸，糖发酵试验。3.3.1 生化试验：产过氧化氢，产硫化氢，葡萄糖产生，硝酸盐复原，产生吲哚，3.3.2 生理试验：乳酸菌产酸力量曲线：将筛选的乳酸菌接种于 MRS 液体培育基中，25-3

11、2培育48h，间隔 4-6h 测定发酵液 pH。食盐对乳酸菌的影响：在 MRS 液体培育基中，添加 0.0 2.0 4.0 6.0氯化钠，菌种分别接种于培育基中，32培育 48h，测定 OD 值。溴甲酚绿指示剂法：原理：溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，碱性环境呈蓝色，分别培育基配制后 PH 为 6.8，参加溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色，产酸后菌落四周变成黄色，较简洁鉴别。培育基：BCG 牛乳养分琼脂初筛：将样品富集液梯度稀释，适温培育，平板上消灭扁平的黄色菌落及四周 培育基也为黄色初定为乳酸菌。复筛：将典型菌落转接脱脂乳发酵管，假设凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色阳性，连续传

12、代假设干次培育，选择出 3-4h 能凝固的乳管保存备用。注：1.乳酸菌筛选常在几种培育基同时进展：分别在麦芽汁碳酸钙培育基，番茄汁碳酸钙培育基，BCP 培育基溴甲酚紫培养基同时进展混菌划线或涂布培育放厌氧袋，分别 25 37培育 48h。菌落观看：平板外表形成浅色黄色或白色小菌落。麦芽汁碳酸钙培育基外表， 菌落四周形成透亮圈，BCP 培育基溴甲酚紫培育基四周使紫色的培育基形成黄色包围圈。落上，假设无气泡产生，证明该菌为触酶阴性。触酶反响：厌氧菌一般无触酶过氧化氢酶，用滴管滴加3.0过氧化氢于菌将各种特征菌落分别接入斜面，培育后保存，进一步生理生化试验，以鉴定分 别何种乳酸菌。2. 菌落鉴定：半

13、固体或双平板琼脂利于乳酸菌的生长，菌落消灭早。2.1 菌落形态观看：乳白色 边缘不整齐，稍呈半球状凸起，实心菌落。个体形态：半透亮 细杆状 链状排列，大量时呈发丝状积存。初步认为乳杆菌。2.2 生化鉴定：在吲哚试验中，参加菌种试管无任何变化，为阴性反响。说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的力量。明胶液化 淀粉水解 氢氧化钾试验均为阴性，说明此菌为乳酸菌。过氧化氢酶 复原硝酸盐糖发酵试验：发酵果糖 半乳糖 葡萄糖 乳糖产酸为阳性反响，其余麦芽糖 蔗糖 棉子糖 鼠李糖产酸为阴性反响。依据手册第九版推断此种乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。纤维二糖 甘露醇 山梨醇 七叶苷 水杨苷2.3 乳酸菌生长曲线

14、pH-t 测定结果：三.几种乳酸菌筛选举例1. 嗜热链球菌：样品来源：市售酸奶 培育基：M17 改进培育基，培育温度：42， 需氧状况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分别2. 保加利亚乳杆菌：样品来源：市售酸奶，培育基：牛肉浸膏 1.5，酵母浸膏0.5，葡萄糖 3.0，柠檬酸三铵 0.2，七水硫酸镁 0.02，琼脂 1.5， pH 5.1。培育温度：42，需氧状况：兼性厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分别法。3. 双歧杆菌：样品来源：婴儿颖粪便，培育基：MRS 培育基、NPNL 培育基 、常规的稀释涂布和划线分别法。TYP 培育基、 PTYG 培育基，培育温度：37，需氧状况：严格厌氧，筛选方法：