2015年生物化学与分子生物学实验课讲义.pdf

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1、实验一 SDS碱裂解法小量制备质粒一、实验目的1.掌握SDS碱裂解法小量制备质粒的原理和方法。2.掌握高速离心机、微量移液器等常规仪器的正确使用。二、实验原理对培养的含有大量质粒的菌液,离心收集菌体,用含一定浓度葡萄糖的缓冲液悬浮菌体,采用碱性SDS裂解细菌的细胞壁，使质粒缓和释放出来。同时整个溶液的pH 为 12-12.5,使断裂成线性细菌染色体DNA变成单链、相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上，当液体的pH调至中性并有高浓度存在下，大部分蛋白质和细菌染色体形成沉淀，而共价闭环质粒DNA仍为可溶状态，离心获得含有大量质粒上清液，用 RNA酶 A 处理除去R N A,用苯酚氯仿除去残留蛋白质，再利

2、用核酸不溶于有机溶剂的性质，从而使其在适当浓度的亲水性有机溶剂 中（乙醇、异丙醇、PEG8000）沉淀析出。三、材料、试剂和仪器1.试剂GT116（含 psiRNA质粒）菌种LB液体培养基溶 液 I、溶 液 H、溶 液 111、无水乙醇、氯仿、异戊醇、Tris饱和酚、RNA酶 A、TE、STE、卡那霉素（配方见附录）2.仪 器 和材料超净台、高速离心机、微量移液器、灭菌eppendorf管和tips、37摇床、旋涡混匀器四、实验操作步骤1.在超净台内从平板上挑取单菌落或用以其它方式保存的菌种接种于3ml LB培养基，在37培 养 15-18个小时。2.向 1 个 2m l的离心管里加约1.5m

3、l的菌液。不要把菌液溅出造成污染。3.10000 rpm离心2 分钟。注意离心机上放置的管重力要平衡，保护离心机。4.弃上清液于废液瓶中。5.重复离心一次，尽量弃去上清。6.加 入 100ul冰冷的溶液I,然后剧烈振荡混匀，置冰上。7.加入200ul溶液H,轻柔混匀，置冰上4 分钟。8.加 入 150ul冰冷的溶液H L 轻柔混匀，置冰上5 分钟。9.12000 rpm离心5 分钟。把上清液转移到另一 1.5ml离心管中（约 450ul）。10.加入等体积的酚：氯仿：异 戊 醇（25：24：1）混合液，剧烈振荡，12000 rpm 离心 2 分钟，小心的收取上层溶液（约 450ul）于另一 1

4、.5ml离心管中。11.加入等体积氯仿：异戊醇，剧烈振荡，12000 rpm离心2 分钟，小心的收取上层溶液（约 400ul）于另一 1.5ml离心管中。12.2 倍 体 积（800ul）-20C预冷的无水乙醇，置冰上10分钟，沉淀质粒DNA。13.12000 rpm离心5 分钟，弃上清14.用 1m l冰预冷的70%的乙醇洗沉淀，轻轻转动离心管，15.12000rpm离 心 I 分钟，弃上清液。16.室温干燥沉淀。加入50ulTE（含 20ug/mlRNA酶 A）溶解质粒，-20保存。五、质粒相关知识质粒是细胞染色外种双链环状DNA分子，它随寄主细胞稳定遗传。对于质粒的研究始 于 1946年

5、，美国科学家Lederberg.J.首先研究了细菌的性因子（F 因子），随后科学家们又相继发现了细菌的抗药性因子（R 因子），大肠杆菌素因子（CoE）等，并对这些染色体外遗传单位的性质、功能及与宿主的关系进行了的深入的研究，为建立第一批重组DNA载体提供了科学的材料。质 粒 DNA在细菌中的复制分为严紧型（stringent control）和松弛型（relaxed control）。严紧型质粒的复制要在蛋白合成时和DNA聚合酶的III存在，只随染色体的复制而复制，其拷贝数少，每个细胞中只有1-10个：松弛型质粒的复制需要使用的是DNA聚合酶I,它在细胞生长周期中随时可以复制，每个细胞中有10

6、-200以上个拷贝。为了便于基因克隆，作为载体的质粒特点如下：1.是个复制子，能自我复制。使它携带的目的基因得到大量扩增。2.分子量小（相对分子质量一般在106-107）,拷贝数要高，便于应用（如便于提取、基因克隆、酶切鉴定、细胞转化、原位杂交等）。3.至少要有两个便于选择的遗传标记，其一用于检查外源DNA是否插入到质粒中，例如载体中引入的LacZ基因，它编码B-半乳糖甘酶氨基端的一个146个氨基酸的a 一 肽，可以被IPTG（异丙基-B-D-硫代半乳糖背）诱导合成，新合成的肽能与宿主细胞所编码的缺陷型半乳糖普酶实现基因内互补，产生有活性的B-半乳糖甘酶，该酶能够水解X-gal（5-溟-4-氯

7、-3 引跺-B-D-半乳糖甘），生成蓝色的浪氯口引跺，使 含 X-gal的培养基中生长的菌落为蓝色。若有外源DNA插 入 LacZ中，因不能合成正确的a 一肽,转化或转染的Lac缺陷菌株，用 X-gal筛选，含阳性无隆载体的菌落为白色，含空载体的菌落为蓝色；其二用于选择已把载体转化到细菌中的菌落，如氨苇青霉素抗性基因（AmpD,只有己转化含有质粒的重组菌在Amp培养基中才能生长。4.有多个单一的酶切位点，起点在某个遗传标记上，便于基因克隆，鉴定。提取的质粒多数以超螺旋型存在，超螺旋的DNA中一个螺旋由10个碱基形成，若一个螺旋大于或小于19个碱基时，分子内就产生一种力量，外于不稳定状态，当分子

8、上有个缺刻时.，分子会立即松驰，形成开环分子。一般超螺旋型质粒应占到总量70%。否则反思你的每步操作是否正确。六、思考题1.分离纯化核酸（质粒DNA）应遵循那些原则（或注意那些事项）？2.溶液I、溶液II、溶液III、酚、氯仿、无水乙醇、等主要试剂各有何作用？实验二分光光度法测定DNA的浓度和纯度一实验目的1.掌握分光光度法估算样品中DNA的浓度和纯度。2.熟悉紫外分光光度计的使用方法。二 实验原理DNA和 RNA吸收光谱的最大值位于260nm,因此可以通过测定OD260来计算样品中DNA和 RNA的浓度,一个0 D 值相当于约50 u g/rnl的双链DNA、40 口 g/ml的单链DNA和

9、 RNA以及33 u g/m l的单链寡核甘酸。利 用 260nm和 280nm两处读数的比值（OD26o：OD28o）可以估算核酸的纯度。三 材料、试剂和仪器1.仪器：美谱达UV-3100紫外分光光度计2.试剂：待测质粒DNA溶液四、实验步骤1.打开外部电源主机电源。2.仪器自检当打开仪器电源时，仪器便进入自检程序，预 热 15分钟，自检各项都“OK”后，进入选择工作方式界面。3.选择菜单第五项“DNA/蛋白质测量”4.按 F2键选择测量方法。“吸光度差1”模式或“吸光度差2”模式被选定后，再选择是否“测量背景”。“吸光度差1”模式测量波长为260nm和 280nm,背景波长320nm；“吸

10、光度差 2”模式的测量波长为260nm和 230nm,背景波长为320nm。3.光度测量未知DNA、RNA浓度的测定：（1）选 择“吸光度差1”模式（3）校零在样品池中放入参比溶液（1XTE）,按【0Abs/100%T】键，仪器进行自动校零，校完后取出参比溶液。（4）测量将取出的参比溶液倒掉，换上样品溶液，放入样品池内，按 START即可测量样品吸光度值。若有多个样品要测试，只需再按TART即可。注意：仅在吸光度为0 1 之间时，吸光度值利DNA浓度才有良好的线性关系。小量制备的质粒DNA浓度 般约为几ug/ul,因此需要稀释约100倍进行测量。如果浓度仍超过测量范围，需要继续稀释。每次至少需

11、向微量比色皿中注入400ul溶液才可准确测量。4.结果计算（1）依据下式计算DNA的浓度：A260X50X稀释倍数=样品浓度（ug/ml）（2）计算比值：A260/A280=DNA的吸收高峰为260nm,吸收低峰为230nm,而蛋白质的吸收高峰为280nm纯 DNAA260/A280为 1.8,纯 RNA A260/A280为 2.0。A260/A280小 于 1.8,则表明样品中混有较多的蛋白质。若 A260/A280接近2.0,则表明样品中含有较多RNA。实 验 三 DNA的琼脂糖凝胶电泳分析一.实验目的1.学习掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法及其运用。二.实验原理由于DNA结构的重

12、复性，核甘酸数相同的DNA几乎具有等量的净电荷，所以核酸携带的电荷的差异几乎不造成对核酸迁移率的差异，而真正决定DNA分子在某一特定电场下的电泳迁移率因素取决于DNA分子的大小、构象、构型。采用适当浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使大小、构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，以达到分离的目的。三.材 料、试剂和仪器1.质粒DNA、细菌基因组DNA2.琼脂糖、6X Loading Buffer DNA 分子量 marker、滨化乙唾（EB）3.仪器：琼脂糖凝胶电泳系统、紫外透射仪、数码相机四.实验步骤1.凝胶的制备（1）配 0.7%的胶：称取0.21g的琼脂

13、糖,置于三角瓶中,加入1XTAE 30m L 盖上铝箔纸，放在微波炉中化胶，注意用中低火（约 1 2 分钟），避免沸腾和溢出。（2）轻旋转三角瓶把胶混匀，使胶的温度冷却至5060。（3）正确安装制胶模及梳子。（4）将琼脂糖溶液倒入胶模中，并防止梳子的齿下或齿间及凝胶中产生气泡。（5）室温静置约30分钟，使胶能完全凝固。轻轻拔出梳子，把胶放入调好水平、装有适量缓冲液的电泳槽内，待用。2.电泳（6）在透明胶带纸上分滴6X 的上样缓冲液1微升/滴，然后于5 微升DNA液混匀，加入到上样孔上（用微量移液器的tip头插入1mm深处，轻轻推进样品，可以看见样品下沉）。同时上标准DNA分子量Markero（

14、7）盖上电泳槽并通电15V/cm,使 D N A 向阳极移动。当指示剂泳动至胶的另一端就可停止电泳。（8）切断电流，取出凝胶，将胶浸入0.5 u g/ml的 EB溶液中10分钟，取出后用水漂洗2 分钟，在紫外透射仪下检查凝胶并摄影。注意：EB是强烈的诱变剂，须小心处理。五.思考题1.哪些因素会影响核酸在琼脂糖凝胶中的泳动？实 验 四CTAB法小量制备大肠杆菌基因组DNA一.实验目的1.掌握用CTAB法小量制备大肠杆菌基因组DNA2.了解基因组DNA的其它提取方法二.实验原理CTAB是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液里，CTAB（十六烷基三乙基溟化镇）与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形

15、成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA。本实验用SDS破碎细胞，利用蛋白酶K 消化蛋白，CTAB沉淀多糖，再经加热使蛋白变性与DNA分离，经酚氯仿抽提后，乙醇沉淀核酸，得到总DNA。三.材 料、试剂和仪器1.大肠杆菌G1162.TE（pH8.0）、CTAB、蛋白酶 K、NaCk 氯仿6.无水乙醇8.仪 器：高速离心机、微量移液器、灭菌叩pendorf管和tips、37摇床、四.实验步骤1.取 1.5ml菌液于2ml离心管，lOOOOrpm离心2 m in,倒去上请，重复该步骤一次。2.加入

16、567MTE（pH8.0）,使菌体完全悬浮。3.加入30回 10%SDS于离心管中，再加入3皿 20mg/ml蛋白酶K,充分混匀。37。（2 反应lh4.加入 100nl5MNaCl,80gI CTAB/NaCl,混匀，65 反应 lOmin。5.加入780卜 il酚/氯仿/异戊酚（25：24：1）,充分混匀，12000rmp室温离心5min。6.转移上清至新的2ml离心管，再加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）,充分混匀，12000rmp室温离心5min。7.转移上清至新的2ml离心管，加 入 1/10体积的3 M 醋酸钠,2 倍体枳的无水乙醇，混匀。8.-2(TC放置30min或者更长时间。

17、9.13000rmp,离 心 lOmin。去上清，加入70%乙静洗涤沉淀，再 13OOOrmp,离 心 lOmin。10.去上清，室温干燥DNA沉淀。II.沉淀干燥后加入20(M”TE(pH 8.0)溶解沉淀。五.思考题试比较细菌基因组DNA和质粒DNA提取方法的异同？实 验 五 质 粒 DNA的酶切分析一.实验目的1.了解酶切原理。2.掌握酶切体系的建立原则。3.熟悉基因工程所用限制性内切酶的特点。二.实验原理分子生物学中使用的DNA限制性内切酶主要是II型 II酶，有 EcoR 1、BamH I、Hind ILHind III等。其识别的特定碱基顺序，并有特异性的前切位点，因而DNA分子经

18、过H 类醐作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。相当一部分酶(如EcoR I、BamH L Hind等)的切口，作用点有180旋转对称性，因而可形成粘性末端，但也有一些I【类酶如A lu l、BsuRL Bal L Hal IIL HPal,Sma I 等切割DNA分子并不产生粘性末端，而只形成平整末端。依据限制性内切酶的生物学活性特点，建立一个细胞体外的液体环境，使酶能够最大限度地发挥其切割DNA的作用。三.材 料、试剂和仪器1.质粒 DNA(psiRNA)2.限制性内切醐Bpil及其Buffer3.仪器：水浴锅、琼脂糖凝胶电泳系统等四.实验步骤1.醐切反应体

19、系质 粒(psiRNA)8 pl1 Ox反应缓冲液 2 出酶(Hindll或BpiD 1 glH2O9 pl2.向一个管内加入以上各个成分，注意各成分的体积要准确，酶最后加入。3.混匀管中的各成分后再离心到管底。4.放在37C,1小时。5.琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，酶切产物可以进一步进行重组。五.思考题1.简要说明切酶反应电泳图谱，其结果说明了什么问题？2.酶切反应的关键有哪些？实验六 质粒载体与外源DNA片段的连接实验目的学习掌握外源DNA与质粒载体的重组连接技术二.实验原理用限制性内切酶（如 B pil）酶切质粒后形成线性化载体，载体带有粘性末端。预先获得的双链目的DNA片段两端也带有与

20、其互补的粘性末端。这样线性化载体的两段就可以目的DNA片段的两段进行正确的配对。在连接酶的催化下，就可以把目的片段连接到质粒载体中，形成含有目的片断的重组载体。此连接产物可转化感受态细胞并进行重组克隆的筛选。三.材料、试剂和仪器1.带粘性末端的双链DNA片段2.酶切过的质粒（psiRNA）3.仪器：恒温仪或低温水浴锅四.实验步骤1.反应体系：20 U1反应体系：u1灭菌蒸储水 13外源片段 3T4 DNA Ligase Buffer（lOx）2酶切过的质粒（psiRNA）1T4 DNA Ligase（5-10U/u 1）12.混匀反应液，在恒温仪中16过夜五.思考题1连接反应中如何优化载体与外

21、源片段的比例？2 目的基因的获得有哪些途径？实验七 CaC12法制备E.coli感受态细胞一、实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法及技术。二、实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0,CaCL低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA的的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 420c短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如 kanamycin等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨芾青霉

22、素的选择性培养基上。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70保 存（有效期 6 个月）。三.材料、试剂和仪器1.G77/6 菌株2.LB培养基3.0.1MCaCl2：4.0.1M CaCl2-MgCl2：5.灭菌甘油6.仪器：冷冻离心机、冰盒等四.实 验步骤1.从冻存管取菌GT116划 LB平板，37T过夜培养。2.挑取形态饱满单菌落，接种3ml LB液体培养基，250rpm,37 过夜培养。3.1：100 转接至 100ml LB 液体培养基，37,250rpm 培养 2 3h,OD600=0.350.4（培养2.5小时后开始取液测O D,每 lOmin测一次，直

23、至O D=0.4,立即停止培养）4.冰上预冷1个 2ml EP管，取菌至EP管，每 管 1.5m l,冰上放置lOmin。5.4000rpm,4,离心 lOmin。6.小心倒掉上清，将管倒置纸巾上Imin流尽残液。7.每管加入500 n 1预冷的0.1M CaCb-MgCb重悬细胞沉淀，冰 浴 15min。8.小心倒掉上清，将管倒置纸巾上Imin流尽残液。9.每管加100 u I 冰预冷的0.1M CaCLz重悬菌体。此时可以按实验八的步骤进行转化实验，也可加入总体积15%的甘油冻存于一80。五.思考题CaCb法制备感受态细胞的原理可能是什么？实 验 八 重 组 DNA的转化和克隆筛选.实验目

24、的1.熟练掌握用重组DNA转化感受态细胞的技术，为基因克隆打好基础2.学习掌握蓝白筛选重组子的原理及操作方法实验原理转化是将外源DNA分子入受体细胞，使之获得新的遗传特征的一种方法，它是微生物遗传、基因工程研究等领域的基本实验技术。本实验用的psiRNA质粒带有卡那霉素抗性基因（Kan）和 LacZ基因。可通过Kan抗性和a 互补两种特征来筛选转化子，即：不带有psiRNA质粒DNA的细胞，因无Kan抗性,不能在含有K an的选择培养基上生长，仅有psiRNA载体的转化子由于具有B-半乳糖甘酶活性，在选择培养基上呈现为蓝色菌落；只带有重组质粒转化子由于失去了6-半乳糖甘酶活性，故呈现为白色菌落

25、，白色菌落就是转化子。转化子扩增后，可将转化的质粒DNA提出，进行电泳和酶切等进一步鉴定。三.材料、试剂和仪器1.GT116感受态细胞悬液2.重组DNA质粒连接溶液3.液体SOC培养基、Kan-SOB培养基平板4.pUC19 质粒 DNA5.灭菌 ddHzO6.X-gal（2%,m/v）：0.2gX-gal,用 10ml 二甲基甲酰胺溶解7.IPTG（20%,m/v）：2g IPT G,加 10ml dH2。溶解8.仪 器：水浴锅、冰盒四.实验步骤1.取 100 U 1摇匀后的感受态细胞悬液（如果是冰冻保存则需在冰上解化冻后进行下述的操作）2.加入重组质粒DNA连接溶液（含量不超过50 n g

26、,体积不超过10ul）,轻轻吹打以混合内容物，冰上放置30分钟。3.将管放入42水浴中，恰好90s。4.快速将管转移到冰浴中，冷却2 min。5.每管加入4001HSOC培养基，（预先加热SOC培养基至37C）,然后将管转移到摇床上lOOrpm轻柔摇动，45min6.将 7ul20%1PTG与 40ul2%X-gal混合，用铺菌器平铺于Kan-SOB培养基平板表面，静置数分钟晾干。7.将菌液用移液器轻轻吹打均匀。将适当体积（每个平板200U1）已转化的细胞转移到铺 有 IPTG和 X-gal的 Kan-SOB培养基平板上。8.将平板置于室温直至液体被吸收。9.倒置平板，3 7 9 培养过夜，观

27、察菌落。1 0.对需显色反应的筛选培养基还需理将平板放于4冰 箱 3-4 小时，使显色反应充分，蓝色菌落明显。五.思考题1.细菌转化实验应注意哪些事项？2.如何理解蓝白斑筛选（a 一互补现象）实验九 利用PCR技术从质粒DNA扩增功能基因一.实验目的学习掌握PCR技术的原理及基本操作.实验原理PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是Kary M ullis在 1985年建立起来的在细胞外扩增合成DNA的一种方法，即利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在附加两个引物与模板杂交之后，按碱基配对的原则经酶促反应合成DNA片断，包括模板变性、引物退火及用 DNA聚合酶延伸

28、两个引物之间的DNA的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5,端限定的特异片断形成指数式枳累。三.材料、试剂和仪器1.重组前和重组后的质粒（psiRNA）DNA2.上游和下游引物3.4 种 dNTPs、Taq polymerase 及其 Buffer、ddH2O4.仪器：PCR仪、冰盒、凝胶电泳检测系统等四.实验步骤1.反 应 体 系（口1）水：38质粒：0.75buffer：5dNTP:4引 物 1:1引物2：1酶：0.252.反应条件94 5min94 30s57 30s72 30s72 7min4 2hI I-30 cycles-3.反应完成后，取 3U1做电泳以鉴定PCR产物。五.思考

29、题1.影响PCR效果的因素主要有哪些？2.举例说明PCR技术的应用实验十考马斯亮蓝法定量测定蛋白质一、实验目的：学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。二、实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（Imax）的位置，由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处

30、光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色法的突出优点是：（1）灵敏度高，（2）测定快速、简便，（3）干扰物质少。但是仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。三、试剂与器材1、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G250 lOOmg溶于50mL 95%乙醇中，加 入 100mL 85%磷酸，用蒸储水稀释至1000mL o2、标准和待测蛋白质溶液（1）标准蛋白质溶液结晶牛血清蛋白，用 0.15mol/L NaCl配制成Img/mL蛋白溶液。（

31、2）待测蛋白质溶液。3、器材恒温水浴；分光光度计。四、实验方法1、制作标准曲线取 7 支试管，按下表平行操作。试管编号0123456标准蛋白溶液（mL）00.010.020.030.040.050.060.15mol/LNaCl(mL)0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂（mL）5mL摇匀，lh 内以0 号管为空白对照，在 595nm处比色A595nm绘制标准曲线：以A595“为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。2、未知样品蛋白质浓度测定测定方法同匕 取合适的未知样品体积，稀释至其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595”加值，在标

32、准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质 浓 度（mg/mL）。注意事项 在试剂加入后的5-20m in内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。测 定中，蛋白一染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。五、思考题试比较该法与其他几种常用蛋白质定量测定方法的有缺点。实验十一蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的掌握蛋白质的SDS-PAGE电泳原理和操作技术及应用。二.实验原理DTT及 B-毓基乙醇等还原剂，能使蛋白质分子中二硫键还原且不易被氧化，蛋白质在SDS存在下能形成SDS-多肽复合物。又知十二烷基磺酸根带有负电，使各种SDS-

33、多肽复合物都带有相同密度的负电荷，而且每克蛋白能与1 4 克 SDS结合，这样复合物中SDS的负电荷量大超过了蛋白质多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质多肽分子间原有的电荷差别，同时，在水溶液中，SD S与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有的构象，所有的 SDS-多肽复合物都具有近似长椭圆的形状，并且不同SDS多肽复合物的短轴长度趋于一致，而长轴与分子量成正比，这样，SDS-多肽复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率不再受蛋白质多肽原有电荷和形状的影响，而只与其分子量有关，并且在一定条件下与迁移率成线性关系，可采用此方法测定未知蛋白质的分子量。三.材 料、试剂和仪器1.E.co菌液2

34、.30%丙烯酰胺混合液3.Tris-甘氨酸电泳缓冲液4.考马斯亮蓝染色液5.甲醇：水：冰醋酸脱色液6.1 X 蛋白质SDS-PAGE上样缓冲液1 ml：7.10%SDS,10%过硫酸胺（现配现用），TEMED8.仪 器：电泳设备、离心机、脱色摇床四.实验步骤1.从保存的菌种平板上挑取单个GT116菌落接种于2ml LB液体培养基中，37振荡培养过夜。2.按 1：100转接至100ml LB液体培养基中，37振荡培养过夜。3.菌 液 1.5ml,10000转/分离心1分钟。4.弃去上清液，向沉淀中加入100 口 1 1XSDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴5 分钟。5.15000rpm离心5 分钟

35、，将上清转移至另一离心管中。取 10u I 进行电泳分析。6.按仪器说明书安装好灌胶装置。标记梳齿下0.7cm的位置。7.按下述配方和顺序，依次混匀各成分制备分离胶，灌胶前才加TEMED。分 离 胶（12%,10ml）H2O3.3ml3 0%丙烯酰胺混合液4.0ml1.5MTris-HCl(pH8.8)2.5ml10%SDS0.1ml10%过硫酸锈0.1mlTEMED（灌胶前加）0.004ml8.一旦加入TEMED后，凝胶即开始聚合。应立即快速旋动混合物并进行下步。9.用 10ml注射器将溶液灌至两块玻璃板之间的间隙中，至液面到达梳齿下0.7cm的位置。尖头滴管小心的在丙稀酰胺溶液上方覆盖一层

36、水。10.待聚合完成（约 30min）,倒掉覆盖层，用去离子水清洗凝胶顶部数次以除去残留的未聚合的丙稀酰胺，尽可能排去凝胶上的液体，再用滤纸条吸尽残留的水。11.按下述配方和顺序，依次混匀各成分制备浓缩胶，灌胶前才加TEMED。浓 缩 胶（5%,4ml）H2O2.7ml30%丙烯酰胺混合液0.67ml1.0MTris-HCl(pH6.8)0.5ml10%SDS0.04ml10%过硫酸镂0.04 mlTEMED（灌胶前加）0.004ml12.将浓缩胶溶液直接灌至聚合好的分离胶上，立即在其中插入一块干净的梳子，注意不要混入气泡，然后再加一些浓缩胶溶液彻底填满梳子之间的孔隙。13.在浓缩胶聚合完成后

37、（约30分钟）小心的拔下梳子，立即用去离子水洗涤加样槽，以除去未聚合的丙稀酰胺。14.将凝胶玻璃板固定在电泳装置上，在上下槽中加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。15.按顺序加样。每个样品加10ul。每加完一个样品后可在下槽缓冲液中洗涤吸头。在不用的样品孔中加等体积的IX SDS凝胶上样缓冲液。16.将电泳装置与电源连接（正极接下槽），在凝胶上加8V/cm电压。待染料前沿进入分离胶后，将电压提高到15V/cm继续电泳，直至澳酚蓝达到分离胶的底部，然后关闭电源。17.从电泳装置上胁下玻璃板，小心撬开玻璃板，切下凝胶一角，记住切角方向。18.将凝胶泡在至少5倍体积染色液中，置于脱色摇床上平缓摇动至少4

38、小时。19.移出染液。将凝胶浸泡于脱色液中，平缓摇动4 8小时，其间更换脱色液三、四次。20.脱色后，将凝胶保存在水中，封存在塑料袋内（可加入20%甘油长期保存）。五.思考题SDS、TEMED、过硫酸胺等试剂有何作用？实验十二 Western Blotting（示教）一.实 验目的了解蛋白质印迹的方法和操作要点。二.实验原理蛋白质印迹（Western blotting）是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。蛋白质印迹（免疫印迹）的实验包括5个步骤：1）固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。2）封闭：保

39、持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上，并与蛋白质反应。3）初级抗体（第一抗体）是特异性的。4）第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5）适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应，或催化底物发光，用胶片记录结果。化学发光底物山于具有更高的灵敏度，近年已得到广泛使用。三.材 料、试剂和仪器1.转移缓冲液2.Tris 缓冲盐溶液（TBS）、TBST3.封闭液：4.丽春灯：S：5.PVDF膜、滤纸6.载有哺乳动物细胞裂解蛋白的电泳凝胶7.第一抗体（兔抗actin）、第二抗体（标记HRP的羊抗兔）8.显色底物（DAB）9.

40、仪器：电转移设备、玻璃器皿、塑料袋四.实验步骤1.戴手套将PVDF膜裁成比凝胶略大的小块。将滤纸裁成比凝胶略小的小块，共六块。2.用甲醇浸泡PVDF膜 2 分钟。（N C膜和尼龙膜无需此步骤）3.将载有蛋白的凝胶、PVDF膜和六块滤纸分别放入转移缓冲液中漂洗lOmin4.将并凝胶、PVDF膜和滤纸做成“三明治”状，滤纸上下各三块。放入转印夹中（见下图）+极_ _ _ _ _ _ _ 印迹夹II 海绵.滤纸 ,PVDF 膜电泳凝胶5.在转印槽中倒入转印缓冲液，将印迹夹放入，胶朝负极，PVDF膜朝正极。6.300mA电流下，转 印 1.5h。7.转印结束后，取下PVDF膜，用丽春红S 染液染色5

41、分钟。8.用水轻柔漂洗PVDF膜 5 分钟，可看到被染色的蛋白质条带。9.将 PVDF膜浸入适量封闭液中，置于脱色摇床上缓慢摇动，室温封闭1 小时。10.用 TBS漂洗膜三次，每次5min。1 1.将-抗按照合适的比例用TBST稀释，将 PVDF膜浸入一抗稀释液中，放在脱色摇床上平缓摇动，4过夜。12.用 TBS漂洗膜三次，每次5min。13.将二抗按照合适的比例用封闭液稀释，将 PVDF膜浸入一抗稀释液中，放在脱色摇床上平缓摇动，室 温 1 小时。14.用 TBS漂洗膜三次，每次5min。15.将膜浸入DAB显色液中显色。小心的观察显色过程。一旦条带颜色深度达到要求，即用水略漂洗终止反应。五

42、、思考题Western blotting的原理是什么？实验十三 应用ELISA技术检测乙肝表面抗原一、实验目的：熟悉ELISA技术的原理和方法二、实验原理：1971 年 Engvall 和 Perlmann发去了酶联免疫吸附剂试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)用于IgG 定量测定的文章，使 得 1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定

43、时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的能量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。EL1SA的类型有：1.双抗体夹心法测抗原联N|1+1双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：(1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及

44、杂质。(2)加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。(3)加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相裁体上一带有的醐量与标本中受检物质的量正相关。(4)加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。2.双抗原夹心法测抗体3.间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用醐标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为

45、间接法。操作步骤如下：(1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。(2)加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。(3)加前标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上的。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。(4)加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。4.竞争法竞争法可用

46、于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如F：(1)将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。(2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。(3)加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深

47、。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。5.捕获包被法测抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：（I）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。（4）加

48、入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。三、仪器、材料、试剂1.HBsAg ELISA检测试剂盒2.酶标仪四、实验方法参照试剂盒使用说明书。五、思考题ELISA的原理是什么？有哪些类型？附录一溶液配方一、培养基1.LB培养基配制每升LB培养基，在 950ml去离子水中加入：胰化蛋白豚 10g酵母提取物 5gNaCl 10g摇动容器至溶质溶解，用 5M NaOH调 pH 值至7.0,用去离子水定容至1L。在 1.05kg/cm2高压蒸汽灭菌20分钟。2.SOB培养基配制每升SOB培养基，

49、在 950ml去离子水中加入：胰化蛋白豚 20g酵母提取物 5gNaCl 0.5g摇动容器至溶质溶解，加 10ml 250mM KC1溶 液（将 1.86g KC1用 100ml去离子水溶解即配成 250mM KC1溶液）。用 5M NaOH调 pH值至7.0,用去离子水定容至1L在 1.05kg/cm2高压蒸汽灭菌20分钟。该溶液在使用前，加入5ml灭菌的2M MgCI2（用 90ml去离子水溶解 19gMgCb，用去离子水调整体积为100m l,在 1.05kg/cm2高压蒸汽灭菌20分钟。）3.SOC培养基SOC培养基除含有20m M 葡萄糖以外，其他成分与SOB相同。SOB培养基经高压

50、灭菌后冷至60或 60以下，加 20ml除菌的1M葡萄糖溶液（用 90ml去离子水溶解18g葡萄糖,用去离子水调整体积为100m l,用 0.22 u 1滤器过滤除菌）4.含有琼脂的培养基按上述配方配制液体培养基，高压灭菌前加入细菌培养用琼脂（15g/L）,在 1.05kg/cm2高压蒸汽灭菌2 0 分钟。温度降至50 60,方可加入不耐热物质（如抗生素）。为避免产生气泡，混匀培养基应采用旋动方式，然后倒置平板。二、缓冲液和其他溶液1.溶 液 I（制备质粒）50mM 葡萄糖、25mM Tris-Cl（pH8.0）、10mM EDTA（pH8.0）,在 LOSkg/crr?高压蒸汽灭菌 15分钟