真核转染稳定筛选标记及原理-PPT.ppt

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1、真核真核细胞胞稳定定转染染筛选标记及原理及原理 小组：周四班二组小组：周四班二组 组员：薛莹超（报告者）组员：薛莹超（报告者）滕达滕达 曾欣宜曾欣宜 席杰席杰 赖惠英赖惠英 邓宇星邓宇星 外源基因表达的三个概念外源基因表达的三个概念 转染转染转染转染 通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。分类分类 转导转导 通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片断的病毒来感染靶细胞。转化 通过生化或者物理方法将目的基因导入原核细胞中。常用的真核表达系统常用的真核表达系统v酵母表达系统v丝状真菌表达系统v昆虫表达系统v哺乳动物表达系统转 染染 方方 法法 理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒

2、性小等特点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高、细胞毒性很低，但准备程序复杂，对细胞类型有很强的选择性很难普及。非病毒介导的转染技术中，以阳离子非脂性物质为主的混合物配方转染效率最高。该类转染具有广谱、细胞毒性小、性能稳定等特点，且不受培养液中的血清和抗生素的干扰，比脂质体介导的转染方法更方便。转染后的表达1.瞬时表达 质粒转染到细胞中，一部分转运进入细胞核，进行转录输出mRNA进行蛋白质合成。几天内大部分的质粒都会被降解或传代而稀释。一周以后几乎检测不到。转染的质粒不整合到染色体上，出现短暂的（24-96h）高水平表达，依赖于质粒纯度、浓 度和转染效率。2.稳定表达 转染的质粒DNA整合

3、到染色体上可以持续存在，转染的细胞可以长期表达。整合的概率比较小，要获得稳定转染的细胞株需要筛选标记共同转染，通过选择压力维持表达稳定。需要长时间的抗性选择培养。酵母表达系统常用的选择性标记酵母表达系统常用的选择性标记v营养缺陷性酵母 trp1-，ura3-，his3-，leu2-，lys2-。v显性选择标记，用于野生型酵母菌的转染。G418筛选。哺乳动物细胞遗传性标记胸苷激酶基因（tk）选择系统二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶基因（HGPRT）选择系统新霉素抗性基因（neo）选择系统氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统潮霉素抗性选择系统细胞内细胞内DNA的合成途径

4、的合成途径细胞的胞的DNA合成有主要途径和旁路途径两种方式合成有主要途径和旁路途径两种方式1.主要途径就是利用谷氨主要途径就是利用谷氨酰胺或胺或单磷酸磷酸脲甘酸在二甘酸在二氢叶酸叶酸还原原酶的催化下合成的催化下合成DNA2.旁路途径旁路途径则是利用次黄是利用次黄嘌呤或胸腺呤或胸腺嘧啶在次在次嘌呤呤鸟嘌呤磷酸核糖呤磷酸核糖转移移酶(HGPRT)或胸腺或胸腺嘧啶激激酶（TK）的催化下）的催化下补救合成救合成DNA。胸苷激酶基因基因选择系统系统v遗传标记：遗传标记：TKv编码产物：编码产物：胸苷激胸苷激酶v筛选药物：筛选药物：HAT选择法法H：次黄：次黄嘌呤；呤；补救合成核苷酸的原料救合成核苷酸的原

5、料A：氨基喋呤；抑制四：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成叶酸合成T：胸苷；：胸苷；补救合成救合成dTTP的原料的原料v作用机理：作用机理：TK是核苷酸是核苷酸补救合成途径的一个关救合成途径的一个关键酶二氢叶酸还原酶（DHFR）基因选择系统v遗传标记：遗传标记：DHFR：真核：真核细胞生物合成核苷酸的关胞生物合成核苷酸的关键酶，功能是催化二，功能是催化二氢叶酸叶酸还原成四原成四氢叶酸叶酸v编码产物：编码产物：二二氢叶酸叶酸还原原酶（DHFR）v筛选药物：筛选药物：叶酸叶酸类似物似物氨基喋呤或氨甲喋呤氨基喋呤或氨甲喋呤v作用机理：作用机理：dhfr缺陷型缺陷型细胞胞因不能合成核酸而死因不能合成核酸而死亡

6、，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且在亡，而导入了外源基因的细胞成功存活，并且在氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。氨甲喋呤的选择压力下大量表达蛋白。黄黄嘌呤呤-鸟嘌呤呤磷酸核糖磷酸核糖转移移酶（XGPRT）基因）基因选择系统选择系统v遗传标记：遗传标记：XGPRTv编码产物：编码产物：黄黄嘌呤呤-鸟嘌呤呤磷酸核糖磷酸核糖转移移酶v筛选药物：霉酚酸筛选药物：霉酚酸v作用机理：作用机理：XGPRT合成合成GMP。哺乳哺乳动物物细胞无胞无XGPRT酶，不能利用黄，不能利用黄嘌呤形成黄呤形成黄嘌呤呤磷酸（磷酸（XMP），但有），但有鸟嘌呤磷酸核糖呤磷酸核糖转移移酶（HGPRT），），可催化黄可催化黄

7、嘌呤形成次黄呤形成次黄嘌呤磷酸（呤磷酸（IMP）。哺乳）。哺乳动物物细胞可胞可通通过IMP生成生成GMP。当用。当用IMP脱脱氢酶抑制抑制剂霉酚酸，抑制了霉酚酸，抑制了GMP的合成，使的合成，使细胞失去合成胞失去合成DNA能力而死亡。能力而死亡。将含将含XGPRT基因的重基因的重组体体导入真核入真核细胞后，能表达胞后，能表达XGPRT酶，可在含有黄，可在含有黄嘌呤的培养基中通呤的培养基中通过XMP中中间体体补救救合成合成GMP，使，使DNA合成正常合成正常进行行。加入霉酚酸后，阳性克隆加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而阴性因不受霉酚酸的抑制而存活，而阴性细胞胞则受霉酚酸的抑制受

8、霉酚酸的抑制而死亡，以此来而死亡，以此来筛选阳性阳性细胞。胞。新霉素抗性基因选择系统v遗传标记：APHv编码产物：氨基糖苷磷酸物：氨基糖苷磷酸转移移酶v筛选药物：新霉素，即物：新霉素，即G418一种氨基糖苷一种氨基糖苷类抗生素，抗生素，影响影响80S核糖体功能核蛋白核糖体功能核蛋白质的合成的合成v作用机理：新霉素抗性基因作用机理：新霉素抗性基因编码3磷酸磷酸转移移酶降解降解G418。适用于所有的真核。适用于所有的真核细胞胞氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统v遗传标记：遗传标记：CAT，大大肠杆菌杆菌Tn9转座子座子编码的催化的催化氯霉素霉素 乙乙酰化反化反应的蛋白的蛋白质v编码产物：编码产物：氯霉素乙霉素乙酰转移移酶v筛选药物：氯霉素筛选药物：氯霉素v作用机理：作用机理：真核真核细胞缺乏胞缺乏CAT，将，将CAT作作为报告基因告基因与目与目的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中的基因一起导入到真核细胞，可在加入氯霉素的培养基中选择阳性细胞。选择阳性细胞。常用于瞬常用于瞬时表达研究表达研究。潮霉素抗性选择系统潮霉素抗性选择系统v遗传标记：遗传标记：HPHv编码产物：潮霉素编码产物：潮霉素B磷酸转移酶磷酸转移酶v筛选药物：潮霉素筛选药物：潮霉素Bv作用机理：作用机理：HPH灭活潮霉素灭活潮霉素B