关于反相高效液相色谱法测定人血浆中艾司西酞普兰的浓度.docx

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1、关于反相高效液相色谱法测定人血浆中艾司西酞普兰的浓度 作者：温预关 廖日房 曾转萍 邓超连 【摘要】 目的 建立测定人血浆中艾司西酞普兰浓度的HPLCFLD法。方法 以DiamonsilTM C18反相柱（250 mm4.6 mm， m）为色谱柱，流动相为乙腈0.03 molL-1醋酸铵（体积比4555，调pH=6.0），流速为0.8 mLmin-1，激发波长：235 nm，发射波长307 nm，以正己烷异戊醇（体积比955）为提取剂。结果 艾司西酞普兰的高（25 gL-1）、中（10 gL-1）、低（1.5 gL-1）3个浓度的平均回收率分别为95.29%、97.01%和97.22%，日内（

2、n=5）、日间（n=3）RSD均小于15%；分析方法的最低定量限为0.5 gL-1，线性范围为0.550 gL-1，回归方程为=20.93A-0.015，r=0.999 9（n=7）。结论 该方法灵敏、准确、简单、快速，可用于临床血浓监测和药动学研究。 【关键词】 艾司西酞普兰；血药浓度；反相高效液相色谱法 Abstract:Objective To set up an RPHPLC method for content determination of escitalopram in human plasma.Methods Escitalopram was extracted with h

3、exaneisoamyl alcohol. The residues were analyzed on an RPHPLC column (Diamonsil C18， 5 m， 4.6 mm250 mm) using a mobile phase consisting of acetonitrile0.03 molL-1 NH4Ac (4555，pH6.0). The fluorimetric excitation and emission wavelength was 235 and 307 nm， respectively.Results The average recoveries o

4、f three concentrations of escitalopram(25，10， 1.5 gL-1) were 95.29%， 97.01% and 97.22%， respectively. Inter (n=3) and intraday(n=5) assay RSD were less than 15%. The calibration curve was linear over the range of 0.5-50 gL-1 ( r = 0.999 9， n=7）and the limit of quantitation for escitalopram was 0.5 g

5、L-1. Conclusion The method is sensitive， accurate， precise and reliable for clinical monitoring of plasma escitalopram. Key words:escitalopram；plasma concentration；RPHPLC 艾司西酞普兰(escitalopram，ETP)是新一代的抗抑郁药物，其对5羟色胺重吸收抑制剂的相对选择性在同类药物中最高，能有效抑制5羟色胺的再摄取，具有很强的抗抑郁作用。目前该药由西安杨森制药股份有限公司首次在国内上市。其检测方法国外采用高效液相色谱法1

6、-2和LCMS检测法3。为便于进行血药浓度监测和药动学研究，本文参照文献4建立了以度洛西汀为内标的测定人血浆中艾司西酞普兰浓度的HPLCFLD法。 1仪器与试药 1.1仪器 Agilent1100 HPLC仪配荧光检测器G1321A，G1313A自动进样器，G1311A自动调配泵，G1316A可调柱温恒温箱，Agilent色谱化学工作站（美国惠普）；旋涡混合器（原上海医科大学仪器厂）；电子天平（瑞士SARTORIUS）；MICRO1224高速离心机（美国）；MMMGROUP真空干燥箱（德国）。 1.2药品和试剂 草酸艾司西酞普兰对照品(西安杨森制药有限公司，批号：050608，质量分数99.5

7、%)，内标物为度洛西汀（美国礼来公司，批号：050621，质量分数99.8%）。乙腈（色谱纯，迪马公司），水为超纯水，其余均为分析纯。 1.3对照品和内标溶液 精密称取草酸艾司西酞普兰适量（含艾司西酞普兰10.0 mg）加乙腈溶解并定容至10 mL，于冰箱4 避光保存。临用时用乙腈水（体积比5050）稀释成所需浓度的艾司西酞普兰对照品溶液。度洛西汀浓度为10 mgL-1的乙腈溶液。 2方法与结果 2.1色谱条件 DiamonsilTM C18反相柱为色谱柱（迪马公司，4.6 mm250 mm， 5 m），流动相为乙腈0.03 molL-1 醋酸铵（体积比4654），用甲酸调pH6.0），流速0

8、.8 mLmin-1，柱温30 ；激发波长：235 nm，发射波长307 nm。艾司西酞普兰和度洛西汀的保留时间分别为6.3 min和8.5 min。见图1。 图1艾司西酞普兰HPLC色谱图 略 2.2样品处理 取1 mL含药血浆加至10 mL锥形玻璃离心管中，加入10 mgL-1的度洛西汀溶液50 L，快速振荡5 s，加入0.1 molL-1的氢氧化钠溶液0.2 mL，振荡5 s。加入3 mL正己烷异戊醇（体积比955）密塞，旋转振荡30 s，3 000 rmin-1离心10 min，吸取有机层转入5 mL锥形玻璃离心管内，30 真空干燥至干。进样前加入0.1 mL乙腈水(体积比5050)溶

9、解，快速振荡10 s溶解残渣，吸取10 L进样。 2.3标准曲线的制备 取空白血浆1 mL 8份，分别加入0、10、20、50、100、200、500、1 000 gL-1浓度的艾司西酞普兰对照品溶液，振荡5 s，使血浆药品质量浓度相当于0、0.5、1、2.5、5、10、25、50 gL-1，然后按血样处理方法处理。经HPLC分析，测得ETP峰面积与内标峰面积之比（A）作横坐标，以血浆ETP质量浓度()为纵坐标，得到0.5.50 gL-1范围的血浆ETP浓度标准曲线。直线方程为：=20.93A-0.015，r=0.999 9。当RS/N=3时，最低检测浓度为0.5 gL-1。分别取5个不同来源

10、空白血浆1 mL，分别加入10 gL-1的艾司西酞普兰乙腈溶液50 L，按照“2.2”项操作，测得结果为(0.540.03) gL-1，RSD为4.75%。 2.4回收率及精密度试验 取高、中、低3种浓度（25、10、1.5 gL-1）制作提取前和提取后的组样品，经色谱分析，以峰面积比较，得到的提取回收率均大于90%。按“2.3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度样品，在1 d内和分散于2周内测定其浓度，计算日内、日间误差及相对回收率。结果见表1。 2.5血浆样品的稳定性试验 按“2.3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度（25、10、1.5 gL-1）的3组血浆样品，分别在室温（放置6、12

11、、24 h ）、长期冻存（-20 冻存1、2、3 星期）和冻融（1、2、3次）条件下分别进行色谱测定，结果见表2。 表1回收率与日内、日间精密度略 表2稳定性考察略 2.6质控样品的监控 按“2.3”项下方法分别配制高、中、低3种浓度（25、10、1.5 gL-1）置-20 冻存，备用，此即为质控样品。每天检测血样品前须按照“2.3”项方法制作随行标准曲线及检测高、中、低3种浓度双份质控样品，如果相对回收率均在85%115%（低浓度可在80%至120%之内）内时，即可认为仪器检测正常，否则须检查整个操作过程以及仪器原因。 2.7临床检测实例 40例抑郁症患者，男25例，女15例，年龄1973岁

12、，平均(2311）岁，连续服药14 d血药浓度达稳态后测定艾司西酞普兰浓度，结果：15例口服5 mgd-1，平均稳态血药浓度为（15.148.00） gL-1；22例口服10 mgd-1，平均稳态血药浓度为（19.088.81） gL-1；3例口服15 mgd-1，平均血药浓度为（62.0823.74） gL-1。 3讨 论 3.1测定波长的选择 在激发波长220400 nm和吸收波长300500 nm范围进行扫描，发现最大激发波长为235 nm，最大吸收波长为307 nm，与文献4报道的236 nm和306 nm相似。 3.2流动相的选择 曾试用乙腈0.03 molL-1醋酸铵为流动相，按不

13、同配比均发现艾司西酞普兰峰拖尾，峰形对称性不理想；用甲酸调pH值为6，乙腈0.03 molL-1醋酸铵的体积比为4555时，峰形对称，半峰宽窄；设定流速为0.8 mLmin-1时，柱温为30 时，出峰时间理想，检测时间比文献4的时间缩短5 min，故采用此色谱系统。 3.3提取溶剂的选择 分别曾试用乙醚、正己烷、醋酸乙酯、乙腈、氯仿和正己烷异戊醇为提取剂，经过比较发现在正己烷异戊醇（体积比955）中的提取率最高，故采用此混合溶剂作为提取剂。 3.4 内标物的选择 经过对萘酚、盐酸普萘洛尔、替米沙坦、度洛西汀等物质或药物的比较发现，替米沙坦与艾司西酞普兰色谱峰分不开，萘酚和盐酸普萘洛尔相离太远，

14、均不是理想的内标物，而度洛西汀与艾司西酞普兰提取条件相似，且色谱峰分得开，内源性物质不干扰，故选择度洛西汀为内标物。 本文方法操作简单、快速，检测结果准确、灵敏度高、重复性好，检测定量限为0.5 gL-1，低于文献5报道的1.3 gL-1，可作为临床常规艾司西酞普兰的血浓监测及其药动学研究的方法。 【参考文献】 1 GREINER C，HIEMKE C，BADER W， et al. Determination of citalopram and escitalopram together with their active main metabolites desmethyl(es-)cit

15、alopram in human serum by column-switching high performance liquid chromatography (HPLC) and spectrophotometric detectionJ. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006，15：1356. 2 SHERBINY D T. Spectrofluorometric determination of citalopram in pharmaceutical preparations and spiked human plas

16、ma using organized mediaJ. J AOAC Int，2006，89(5):1288. 3 SMYTH W F， LESLIE J C， MCCLEAN S， et al. The characterisation of selected antidepressant drugs using electrospray ionisation with ion trap mass spectrometry and with quadrupole time-of-flight mass spectrometry and their determination by high-performance liquid chromatography/electrospray ionisation tandem mass spectrometryJ. Rapid Commun Mass Spectrom，2006，20(11):1637. 4 温预关，马崔，赵振环，等.氢溴酸西酞普兰片的人体相对生物利用度J.中国临床药学杂志，2006，15(1)：43. 5 刘晓，张相林，李凯鹏，等.高效液相色谱-荧光法测定人血浆中西酞普兰含量J.药物分析杂志，2005，25(10): 1186.