悬浮细胞培养.docx

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1、悬浮细胞培育（颜秋生、张雪琴）悬浮细胞培育是指已建立的愈伤组织或离体的植物细胞，转移到液体培育基中进行无菌振荡 培育。用这种培育方法所得的细胞，较为匀称全都，它不仅为讨论细胞的生长和分化供应了一个 独特的试验系统，而且细胞增殖速度快，适于进行大规模培育，在植物产品工业化生产上有巨大 的应用潜力。1仪器设施超净工作台、高压灭菌器、旋转摇床、台式离心机、荧光显微镜、刻度离心管Q5ml）、三角 瓶（300ml）、吸移管等。2操作方法2.1 悬浮细胞的培育愈伤组织的诱导：经过表面清毒的植物外植体，置于含有适当激素的固体培育基上，即可建 立起组织培育物。通常使用的激素包括生长素和细胞分裂素。在这种培育基

2、上，外植体愈伤组织 化，这个过程一般是由切口开头，渐渐扩展到接种组织的整个表面。把愈伤组织由外植体上剥离, 转移到成分相同的新奇培育基上，这个过程称做继代。通过反复地在琼脂培育基上继代，不但可 使愈伤组织不断增殖，扩大数量，而且还能提高愈伤组织的松散性，这对于在液体培育基中建立 充分分散的细胞悬浮培育物是特别必要的。分批悬浮培育一般技术：把已建立的外观松散、生长快、浅黄色的愈伤组织转移到含有液体培育基的三角瓶中，然后置于旋转摇床上不断振荡，由此得到的培育物叫做悬浮细胞培育物、 在培育过程中，除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。培育所用 的容器一般是100-250ml三

3、角瓶，每瓶中装有20-50ml培育基。摇床的转速是可控的，对于大 多数植物组织来说，以转速30-150转/分为宜，冲程范围应在2-3cm左右。转速过高或冲程过大 会造成细胞的裂开。当培育基中的主要养分物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。为了使培 育的细胞能不断增殖，必需进行继代，方法是取出培育瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的 新奇培育基中（大约稀释5倍）。培育用的液体培育基，对某一特定种而言，凡适合愈伤组织生长 的培育基，只要除去其中的琼脂，均可作为悬浮细胞培育基。在对悬浮培育细胞进行继代时可使 用吸移管，继代前应先使三角瓶静置数秒，以便让大的细胞团沉降下去，然后再由中层吸取悬浮 液。悬

4、浮培育初期，每隔3天继代换液1次。继代10-15次后，可每隔7天继代换液1次。依这 个方法操作，就可逐步建立起抱负的悬浮细胞培育物或悬浮细胞系。悬浮细胞系建立过程，通常 可分为前期（悬浮培育开头至悬浮培育2周）、中期（悬浮培育15-90天）和后期（悬浮培育3-4个 月以后）。不同培育时期的悬浮细胞其形态特征具有很大的差别。前期细胞由不规章瘦长的细胞组 成，细胞质稀、液泡大，呈透亮状；中期细胞由不规章细胞和椭圆形细胞组成，随着时间的增加椭圆形细胞的比例渐渐增加，且细胞质亦由稀变浓；后期细胞均由圆形或椭圆形细胞 组成，细胞质深厚，具有丰富的颗粒状内含物，细胞团通常由10-30个不等的细胞组成。2.

5、2 悬浮细胞的测定细胞生长的计量（1）细胞鲜重把悬浮细胞倒在已知重量的湿尼龙丝网上，用水洗去培育基，真空抽滤以除去细 胞上沾着的多余水分，再称重，细胞鲜重以每亳升悬浮培育物的重量来表示。（2）细胞干重用已知重量的干尼龙丝网依上法收集细胞，置60烘箱中干燥12-24小时，再 称重，细胞干重以每毫升悬浮培育物的重量来表示。细胞密实体积(PCV)取10ml细胞悬浮液，放入15ml刻度离心管中，在2000xg下离心 5分钟，在离心管上可得到细胞沉积的体积。细胞密实体积是以每毫升细胞悬浮液中细胞体积的毫 升数表示之。细胞活力的测定(1)相差显微术法在显微镜下，依据细胞质环流和正常细胞核的存在与否，即可鉴

6、别出细胞的 死活。采用相差显微镜可以得到更明显的图象，但在亮视野显微镜下经常也不难进行这样的观看。(2)二乙酸荧光素(FDA)法应用这种方法可以对活细胞百分数进行快速的目测，首先用丙酮制 备0.5%的FDA贮备液，置0下保存。当要测定细胞活力时，将贮备液加到细胞悬浮液中，加入 的数量以使最终浓度为0.01%为准。混匀，在室温下作用5分钟，然后在带有适当的激发滤片和 汲取滤片的荧光显微镜进行观看。FDA本身无荧光、无极性，可自由透过细胞质膜进入内部，进 入后由于受到活细胞内脂酶的分解，而产生有荧光的极性物质荧光素，它不能自由出入质膜。在 荧光显微镜下可观看到产生荧光的细胞，表明是有活力的细胞；相反，不产生荧光的细胞，表明 是无活力的死细胞。细胞活力以发绿色荧光的活细胞数占总观看细胞数的百分数表示。(3)伊文思兰染色法这种方法可用做FDA的互补法。当伊文思兰的淡薄溶液(0.025%)对细胞进 行短时间的处理，只有活力已受损伤的细胞能够摄取这种染料，而完整的活细胞不能摄取这种染 料。因此，凡不染色的细胞皆为活细胞。但是染色时间不能太长，否则活细胞也会渐渐积累染料 而染成颜色。细胞活力以未染色的活细胞数占总观看细胞数的百分数表示。*悬浮细胞培育：原载现代植物生理学试验指南，中国科学院上海植物生理讨论所等编,科学出版社，1999年12月，P.3738.