阿尔茨海默病与代谢相关因子水平的研究_陈敏.docx

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1、 分类号： R749. 16 密级： 单位代码： 10422 学 号： 200913320 论文题目：阿尔茨海默病与代谢相关因子水平的研究 Relationship of metabolism-related factors and Alzheimer?s disease 作者姓名 陈敏 _ 学院名称 医学院 _ 专业名称 神经病学 _ 指导教师 单培彦教授，刘爱芬副教 授 合作导师 _ 2 0 1 2 年 4 月 11 日 原 创 性 声 明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表

2、或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定 ） 关于学位论文使用授权的声明 目录 中文摘要 . 1 砂 _ . 4 狀说 M . 7 论文正文 前 . 8 第一部分 材料与方法 . 10 關 . 18 i 报 . 20 第

3、二部分 材料与方法 . 22 会課 . 25 讨论 . 26 参考文献 . 28 雜 . 31 纖 . 32 麵 . 43 攻读学位期间发表的学术论文 . 44 CATZLOGUE Abstract(Chinese) . 1 Abstract(English) . 4 Abbreviation . 7 Introduction . 8 Part one Materials and methods . 10 Results. 18 Discussion . 20 Part two Materials and methods . 22 Results. 25 Discussion . 26 Ref

4、erence . 28 Conclusion . 31 Overview . 32 Thanks . 43 The published articles . 44 ip 山东火学硕士学位论文 阿尔茨海默病与代谢相关因子水平的研究 专业：神经病学 硕士研究生：陈敏 导师：单培彦教授，刘爱芬副教授 中文摘要 背景 阿尔茨海默病 （ Alzheimers disease ,AD)是发生于老年期和老年前期，以进 行性认知功能下降和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变，是老年期痴呆 的最常见类型。自 1907 年德国神经病理学家阿尔茨海默首次报告以来，该疾病 的特征越来越被人们所认识。近年来随着我国人

5、口老龄化的加重，阿尔茨海默病 的发病率及患病率也逐渐增高。但阿尔茨海默病的发病机制尚不完全明确，代谢 障碍可能是引起阿尔茨海默病的病因之一。糖代谢异常导致 AD 的潜在机制可能 与高血糖的直接毒性，低血糖导致大脑能量供应不足，胰岛素抵抗及胰岛素信号 转导异常，胰岛素降解酶 (insulin-degrading enzyme,IDE)基因异常等有关。脂源性 因子痩素 (leptin,LP)是 1994 年发现的由脂肪组织分泌的激素，与糖代谢障碍、肥 胖等密切相关。近年来发现瘦素对阿尔茨海默病的发生起保护作用，瘦素水平下 降可能参与阿尔茨海默病的发病过程，。因此，研究代谢相关因子胰岛素、胰岛 素降

6、解酶及瘦素与 AD 的关系，有助于了解 AD 的发病机制，为治疗和预防阿尔 茨海默病提供新的思路和方法。 第一部分 阿尔茨海默病患者血糖、胰岛素及胰岛素降解酶水平的研究 目的： 探讨阿尔茨海默病与血糖、胰岛素及胰岛素降解酶的关系，为进一步防治阿 尔茨海默病提供理论依据。 方法： 选择 32 例阿尔茨海默病患者 (实验组 )和 30 例正常老年人 (对照组 )，进行简 山东火学硕士学位论文 明精神状态量表 (MMSE)及临床痴呆评定量表 （ CDR)评分，按照 CDR 得分再 将实验组分为轻、中、重度组。同时测量两组的身高、体重、空腹血糖、血脂等， 采用酶联免疫吸附法和化学发光法分别检测其血清胰

7、岛素降解酶 (IDE)和胰岛素 水平并计算胰岛素抵抗指数及体质量指数，对上述因子进行统计学分析，寻找各 因子之间的相互关系。 结果： 1、 独立样本？检验结果显示实验组与对照组在身高、体重、 BMI、 空腹血糖、 总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、胰岛素及胰岛素抵抗指数 方面无显著差异 CP0.05)。 2、 独立样本 /检验结果显示与对照组相比，实验组血清 IDE 水平下降 （ P0.05)。 结论： 胰岛素降解酶水平的下降，与阿尔茨海默病的发生有一定相关性，在阿尔茨 海默病患者体内胰岛素降解酶对胰岛素及胰岛素抵抗的调节可能出现障碍。 关键词：阿尔茨海默病；胰岛素；胰岛素降解酶

8、 第二部分 阿尔茨海默病患者瘦素水平及与糖代谢关系的临床研究 目的： 探讨阿尔茨海默病患者瘦素水平的变化及瘦素与血糖、胰岛素、胰岛素抵抗 之间的关系，为进一步防治阿尔茨海默病提供理论依据。 方法： 选择 32 例阿尔茨海默病患者 (实验组 )和 30 例正常老年人 (对照组 )，进行 MMSE及 CDR 评分，实验组按照 CDR 得分再分为轻、中、重度组。两组同时 2 山东大学硕士学位论文 测量身高、体重、空腹血糖、血脂等，采用酶联免疫吸附法和化学发光法分别检 测其血清瘦素和胰岛素水平并计算胰岛素抵抗指数及体质量指数，分析瘦素、胰 岛素及胰岛素抵抗指数之间的关系，寻找在阿尔茨海默病中瘦素水平及

9、其与胰岛 素之间的关系的变化。 结果： 1、 独立样本？检验结果显示实验组与对照组在胰岛素及胰岛素抵抗指数水平 无显著差异 P0.05)。 2、 独立样本 （ 检验结果显示与对照组相比，血清瘦素水平明显下降 （尸 0.05)。 结论： 瘦素水平的下降，与阿尔茨海默病的发生有一定相关性，痩素可能是 AD 的 保护性因子；在阿尔茨海默病患者体内瘦素与胰岛素及胰岛素抵抗之间的调节作 用可能出现障碍。 关键词：阿尔茨海默病；胰岛素；瘦素 3 山东人学硕士学位论文 Relationship of metabolism-related factors and Alzheimers disease Majo

10、r: Neurology Postgraduate: Chen Min Supervisor: Shan Peiyan, LiuAifen ABSTRACT Background: Alzheimers disease (AD) is a degeneration of central nervous system, characterized by progressive decline in cognitive, decrease in daily living and may be associated with various psychiatric symptoms and beha

11、vior disorders .The incidence rate of the disease has been rising since German neuropathologist, Alois Alzheimer, reported for the first time in 1907.In recent years, with the increase of aging population ,the incidence of Alzheimerfs disease is gradual high in China. Though the pathogenesis of Alzh

12、eimers disease is not yet totally clear , metabolic disorders may play an important role in the development of Alzheimerfs disease. There may be many complicated potential mechanisms which make abnomal glucose metabolism lead to AD, including direct toxicity caused by high blood glucose, short energ

13、y supply in brain because of low blood sugar, insulin resistance , abnormalities of insulin signal transduction or insulin degrading enzyme gene， and so on. Leptin is secreted by adipose tissue which was discovered in 1994, it is closely related to glucose metabolism disorders, obesity, and so on .I

14、t was found that leptin may be the protective factor in the course of Alzheimers disease in recent years. Therefore, it helps us to understand the pathogenesis of AD by exploring the association between the metabolism-related factors (insulin, insulin-degrading enzyme and leptin) and Alzheimers dise

15、ase, in order to find new potential avenues for prevention and treatment of Alzheimers disease. PART ONE Analysis of plasma fasting glucose, fasting insulin and insulin degrading enzyme 4 山东大学硕士学位论文 levels in Alzheimer disease Objective: To explore the association between diabetes-related factors(fa

16、sting glucose, fasting insulin and insulin degrading enzyme) and Alzheimers disease (AD). Methods: 32 patients with AD(the patient group) and 30 normal elderly subjects (the control group) were enrolled. The two groups were all tested by Mini-mental state examination(MMSE) and the patient group was

17、divided into the mild, medium and severe groups with Clinical dementia rating(CDR).Blood samples were used for determining serum fasting insulin(Fins) by chemiluminescence assay and insulin degrading enzyme(IDE) by enzyme linked immunosorbent assay. Results: 1. There were no significant differences

18、between the experimental group and the control group in height, weight, BMI, fasting blood glucose, total cholesterol, triglyceride concentration, low density lipoprotein cholesterol, high density lipoprotein cholesterol, insulin and insulin resistance index (P0.05). 2. The serum IDE in the patient

19、group was declined compared with the control group ( P 26 分； HAMD 分值 12 年 ） $24 分，得分在 27-30 分为 正常， 3 分，或总分 26 分，则表示有明确的曰常 生活能力减退。 5、 汉密尔顿抑郁量表 （ Hamilton depression rating scale, HAMD) (24 项版 ） ： 用于评定抑郁程度，并与假性痴呆进行鉴别。包括抑郁情绪、迟缓、入睡困难、 睡眠不深、早醒、有罪恶感、绝望感、自杀倾向、工作和兴趣下降、激越、躯体 性焦虑、精神性焦虑、胃肠道症状、全身症状、体重减轻、自知力下降、疑

20、病、 昼夜节律紊乱、人格障碍、强迫症状、偏执症状、能力减退感、自卑感。采用 0-4 分的 5级评分法无； “1” 轻度； “2” 中度； “3” 重度； “4” 很重。部分釆用 0-2分 3 级无 ;“1” 轻 -中度； “2” 重度。结果评定标准 :总分 35 分严重抑郁， 20-35 分中 度抑郁， 8-20 分轻度抑郁， 7分可能有焦虑； 14 分肯定有焦虑； 21 分 肯定有明显的焦虑； 29 分可能为严重焦虑。 7、 Hachinski 缺血指数量表 （ Hachinski ischemic score， HIS)是 1975 年由 Hachinski 制定的血管性痴呆简易检查量表。

21、该版本采用由量表协作研究组（樊 彬等）于1988 年修订的中国常模。本量表是专门用于血管性痴呆简易检查和鉴 别的量表，由急性起病、阶梯式恶化、波动性病程、夜间意识模糊、人格相对保 持完整、情绪低落、躯体诉述、情感失禁、有高血压病或高血压史、脑卒中史、 动脉硬化、局灶神经系统症状、局灶神经系统体征等 13 个项目组成，它来源于 临床经验，有 Hachinski 与 Rosen 两种记分法，本测试采用 Hachinski 记分法。 施测时间约 15-20 分钟。 HIS 能有效地鉴别血管性痴呆。对于血管性痴呆和老年 痴呆的区分，有很好的敏感性、特异性、阳性预测、阴性预 测及有效性。 结果评定： H

22、achinshi 法总分：满分 18 分。得分 7 14 山水大学硕士学位论文 属血管性痴呆， 4-7 分属混合性痴呆。 (四）胰岛素、胰岛素抵抗指数及胰岛素降解酶测定方法 1、 标本的采集与处理 实验组所有血液标本均取自齐鲁医院 2010 年 4 月 -2011 年 9 月就诊于神经科 门诊及病房的病人。血样经患者知情同意后采集。整个采血过程由医院护士完成， 并严格按照釆血操作规范进行，过夜禁食 12 小时后，晨起空腹抽取静脉血 5ml 于生化管中， 2000rpm离心 15min， 分离血清，保存于 -80C 冰箱，以备指标的检 测。对照组来自同期门诊及病房健康体检者，经本人知情同意后按上

23、述方法采集 保存。 2、 主要试剂及实验仪器 2.1主要试剂 人胰岛素降解酶 ELISA 试剂盒：瑞士 Bachem 公司产品， 96 孔板， 2-8C 低 温保存。实验前提前 30 分钟将试剂置于室温下平衡后方可使用。底物需避光保 存。 2.2 主要仪器 (1) Milli-Q Century 超纯净水系统：美国 Millipore 公司。 (2) 微量移液器：德国 Eppendorf。 (3) 电热恒温水浴锅：上海医疗器械三厂。 (4) -20 C 冰箱：青岛海尔公司。 (5) -80C 低温冰箱：美国 HARRIS 公司。 (6) 恒温烤箱：北京医疗设备厂。 (7) 低速台式离心机：上海

24、安亭科学仪器厂。 (8) MultiskanMK3 型全自动中文酶标仪：芬兰雷勃。 3、 实验方法 3.1 罗氏电化学发光法测定胰岛素含量 胰岛素的测定由齐鲁医院内分泌实验室完成，并严格按照罗氏化学发光法操 作规范进行统一检测。依据公式计算胰岛素抵抗指数，计算公式：胰岛素抵抗指 数 (insulin resistance index, HOMA-IR)=FPGxFins / 22 5。 3.2 ELISA 检测人胰岛素降解酶含量 山东大学硕士学位论文 1) 标准品的稀释：采用倍比稀释。取 5 个 EP 管，分别标上 1-5 号，在 1 号管中加入原倍标准品 120 卟然后加入标准品稀释液 12

25、01，充分混勻；从第 1 管中吸取 120 叫液体加入第 2 管中，再在第 2 管中加入标准品稀释液 120 叫，充 分混匀；再从第 2 管中吸取 120 叫液体加入第 3 管中，在第 3 管中加入标准品稀 释液 1201，充分混匀；然后从第3 管中吸取 120 叫液体加入第 4 管中，在第 4 管中加入标准品稀释液 120 闷，充分混匀；最后从第 4 管中吸取 120 叫液体加入 第 5 管中，在第 5 管中再次加入标准品稀释液 120叫，充分混匀。 C 稀释后各管样 本浓度分别为 40ng/ml， 20ng/ml， 10ng/ml， 5ng/ml，2.5ng/ml) 2) 加样：设第 1-

26、5 孔为标准品孔 （ 标准品孔不加抗胰岛素降解酶抗体，其 余各步骤操作相同），分别取 1-5 号 EP 管中标准品 50|_il， 设第 6 孔为空白孔（空 白孔不加样品、抗胰岛素降解酶抗体及链 霉亲和素 -HRP， 其余各步骤操作相同）， 余孔为待测样品孔。在在酶包被板上标准孔中分别加入 1-5 号 EP 管中的标准品 501,待测样品孔中先加入样品 401，然后再加抗胰岛素降解酶抗体 101。加样 时将样品加于酶包被板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混勻。每孔加入链霉亲 和素 -HRP 试剂 50 叫，空白孔除外。 3) 温育：用封板膜封板后置于 371:恒温水浴箱内震荡孵育 60min。

27、4) 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用。注意洗涤液可能 会有结晶析出，稀释时可以在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 5) 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，用力甩干，然后每孔加满洗涤液， 静置 30秒钟后弃去，如此重复 5 次，置于吸水纸上拍干。 6) 显色：每孔先加入显色剂 A 500，然后再分别加入显色剂 B 500，轻轻 震荡混勻， 37C 避光显色 10 分钟。 7) 终止：每孔加入终止液 501,终止反应，此时蓝色立即转为黄色。 8) 测定：以空白孔调零， 450nm 波长依序测定各孔的吸光度 OD 值。测定 应该在加终止液后 10 分钟以内进行。注意若不能立

28、即上机检测，需将板置于 4 避光保存，并应于 1 小时内检测。 三统计学处理 1) 应用统计学软件 SPSS 19. 0 进行统计分析。 2) 对各研究变量进行描述性分析。 16 山东人学硕士学位论文 3) 所有计量资料以 i 廿表示。均进行正态性和方差齐性检验，不符合正态 分布的变量，进行自然对数转换使之成为正态分布或近似正态分布，两组数据间 比较釆用独立样本；检验，组内比较采用单因素方差分析。计数资料的组间比较 米 用 检 验 。 相 关 性 分 析 米 用 办 相 关 分 析 法 。 4) P . 5)。 实验组血清 IDE 水平较 对照组有明显下降 （ PU5)， 两组在身高、体重、

29、BMI、 血脂、空腹血糖方面 均无统计学差异 （ P . 5)。 见表 1。 表 1 两鉬受试者枪测指标对比 （ x ) 指标 病例钼 Cn=32) 对照组 （ n=30) P 刼高 （ m) 1.64 士 0.08 1.67 土 0.06 0.25 体重 （ kg) 64.5010.11 65.20 士 6,98 0.75 BMI (kg/m2) 23.843.34 23.55 士 2.51 0.70 Cho (mmol/L) 5.15 士 0.87 4.970.77 0.38 TG (mmol/L) 1.32 士 0.69 1.25 士 0.59 0.71 HDL-C (mmol/L) 1

30、.470.37 1.38 土 0.32 0.27 LDL-C (mmol/L) 3.18 土 0.66 3.12 土 0.73 0.76 FPG (mmol/L) 5.23 士 0.62 4.98 土 0.47 0.08 Fins (ulU/ml) 7.91 土 6.56 9.28 士 5.40 0.21* HOMA-IR 1.80 土 1.41 2.071.23 0.32* IDE (ne/ml) 26.79+10.90 32.5512.97 0.04* 4 经然对数转换后 2. 2 空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数与 IDE 的相关性研究分别对实 验组及对照组的空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗

31、指数与 IDE 水平进行孕 earman 相关分析，阿尔茨海默病患者 IDE 水平与 FPG、 Fins、 HOMA-IR 均无相关性， 而正常人 IDE 水平则与Fins 及 HOMA-IR 呈正相关。见表 2。 表 2 两纟 FI IDE 水平与 FPG、 Fins、 HOMA-IR 的相关比较 病例组 对照组 FPG Fins HOMA-IR FPG Fins HOMA-IR IDE / 值 -0.07 0.02 -0.02 0.19 0.57 0.60 尸信 0.71 0.94 0.91 0.32 0.00 0.00 18 山东大学硕士学位论文 2. 3 血糖、血脂、胰岛素及胰岛素抵抗

32、指数对阿尔茨海默病患者认知的影 响对实验组血糖、血脂及相关血液学因子与 MMSE 得分进行办 earman 相关分 析，空腹血糖与认知功能呈负相关，其他血液学相关因子与认知功能无相关性。 见表 3。 表 3 血管危险因素对阿尔茨海默病患者认知及日常生活能力相关性比较 （ r 值 ) 项目 Cho TG HDL-C LDL-C FPG Fins HOMA-IR MMSE r 值 -0.06 -0.01 0.27 -0.22 -0.36* 0.17 -0.20 尸倌 0.75 0.99 0.14 0.23 * 0.04 0.36 0.27 P5 为差异有统计学意义。 24 山东大学硕士学位论文 结

33、果 2. 1 实验组与对照组的一般资料比较两组采用检验在性别、年龄、受 教育程度等一般临床资料差异均无统计学意义 CP . 5)。 两组在 BMI、 胆固醇、 甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖等血管危险因素方面 均无统计学差异（ /* . 5)。结果参见第一部分表 1。 2. 2 血清瘦素、胰岛素水平比较血清瘦素在实验组与对照组之间差异有统 计学意义，而胰岛素及胰岛素抵抗在两组中无统计学差异。见表 4。 表 4 两组受试者痩素、胰岛素及胰岛素抵抗指数的对比 指标 实验鉬 （ n=32) 对照组 （ n=30) P 瘦素 （ ng/ml) 398.22159.73 504.8

34、4 土 176.19 0.01 Fins (uIU/ml) 7.91 士 6.56 9.28 士 5.40 0.21* HOMA-IR 1.801.41 2.07 士 1.23 0.32* +经自然对数转换后 2. 3 不同痴呆严重程度的 AD 患者血清瘦素水平的比较实验组按照痴呆严 重程度对轻度组、中度组及重度组血清痩素浓度水平进行单因素方差分析， 3 组 间无统计学差异（户 0.05)。 2. 4 血糖、胰岛素与瘦素的相关性分析血糖、胰岛素分别与实验组及对照 组瘦素水平的办相关分析显示，对照组中瘦素与胰岛素及胰岛素抵抗呈 正相关，而在实验组中无相关性。见表 5。 _ 表 5 两组瘦素水平与

35、 FPG、 Fins、 HOMA-IR 的相关比较 _ 实验组 对照组 FPG Fins HOMA-IR FPG Fins HOMA-IR 瘦素 H 直 -0.05 0.08 0.05 0.03 0.43 0.47 尸倌 0.77 0.67 0.77 0.86 0.02 0.01 25 山东大学硕士学位论文 讨论 脂源性细胞因子主要由脂肪细胞分泌，脂肪组织不仅是一个储存能量的场 所，还是一种内分泌器官，可分泌多种脂肪因子 2()，包括瘦素、内脂素、脂联 素等，这些激素参与糖代谢过程，与阿尔茨海默病的发生有密切关系。其中近年 来研究较多是痩素。瘦素可参与糖、脂肪及能量代谢的调节，痩素水平下降与

36、AD 的发生密切相关。瘦素对 AD 的作用机制尚不完全清晰，在体外实验中发现 瘦素激活腺苷酸活化蛋白激酶（ 5-AMP-activated protein kinase, AMPK)信号转 导途径及 sirtuins (SIRTs),从而减少细胞内 Tau 蛋白磷酸化和 P-淀粉样蛋白的 产生 KIrez-Gonz 纪 ez 等发现在A(3PP/PS1 小鼠中，瘦素诱导神经祖细胞的增殖， 有类似神经营养和保护的作用 5。本研究发现与对照组相比，实验组患者瘦素水 平明显下降，提示 AD 患者体内瘦素水平不足，可能影响 AD 的发病，痩素可能 对认知功能有保护作用。 Gunstad 等对 35 例

37、无明显神经及精神障碍的老年人进行 空腹瘦素检查发现瘦素水平与认知功能呈负相关 21。Biqalke 等对 41 例 AD 早期 患者及 37 例年龄及体重相比配的健康人血浆进行分析发现血浆瘦素水平下降与 AD 相关 22。 Lieb 等对 789 例老年人平均 8.3 年的随访调查中发现痩素水平与 AD存在明显的负相关性，低瘦素浓度组 12年后 AD的发生率大约是高浓度组 的4 倍，考虑痩素可能是老年人脑老化的生物标记物之 一 23。 Holden 等对 3075 例社区 70-79 岁老年人进行长达 5 年随访，进行 MMSE 及瘦素检测，发现随着 年龄的增长，在 MMSE分值水平上，低瘦素

38、组 MMSE 分值下降较高痩素组明显， 与低瘦素组相 比，高瘦素组中约 50%的受试者可延缓认知功能的下降。证实在 老年人中高血清痩素对认知有保护作用 24。但不同严重程度的 AD 患者之间瘦素 水平并未有明显差异，提示瘦素水平下降可能在早期影响 AD 的发生，而与 AD 的进展无关。 本研究还发现对照组中瘦素与胰岛素及胰岛素抵抗呈正相关，而实验组无此 相关性。提示在正常人体内，随着胰岛素水平的增高，瘦素的合成增加，而在 AD 患者体内，这一调节出现障碍。通过对瘦素转基因小鼠体内注射瘦素后发现， 在糖尿病小鼠模型中，过度表达的瘦素可增加葡萄糖代谢及改善胰岛素敏感性 25,26。连续 2 周对链脲霉素 （ STZ)诱导的慢性高血糖大鼠侧脑室中注射痩素后 发现，注射瘦素组大鼠较对照组对胰岛素的敏感性明显增加，提示中枢系统瘦素 26 山东大学硕士学位论文 信号不足可能与胰岛素抵抗有相关性 27。 Chinoo