水产动物育种学资料 (8).pdf

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1、第 2 2卷第 6期 2 0 0 3年 1 1月 水 产 科 学 FI SHER I ES SCI ENCE Vo1 22 No 6 NO V 2 0 03 紫外线 照射对 光棘球海胆精子遗传失活 和授精 能力 的影 响 摘 要：用 不 同照射剂 量 的紫 外线 照射光 棘球 海胆 的精子，然后 与正常 的成 熟卵 子授 精。在 照射强 度 为 0 7 5 mw(h-c m )，温度 2 2 C的条件 下，照射时 间 为 0 1 8 0 s，授精 率 随照射 时 间的增加 而下 降，但 是在 1 1 0 1 3 0 s 内又 略有 回升。用 遗传 失活精 子授精 可激 活卵子，其早 期胚 胎

2、的成 活率 随照射 剂量 的增 加依 次为 5 7 、4 9 、4 1 、2 0 、1 2 5、4 8 6、6 1、3 0 5、1 6。从 早 期胚 胎成 活率 上 可以看 出“H e r t w i g 效 应”的存在。观察精 子 遗传 失 活 和授精 激 活 卵子 的 情 况，其 结 果 是在 紫 外线 照 射强度 为 0 7 5 mw(h c m)，照射 时间 为 1 3 0 s，精 液厚度 为 0 1 mm 的条 件下，精 子可 以完 全遗 传 失活，用这 种失活 精子授 精可 激活 卵子进 行胚 胎发育。关 键词：光棘 球海 胆；精 子；紫外 线 照射；遗传失 活；H e r t w

3、i g效 应 中图分 类号：s 9 6 8 9 文献 标识码：A 文章 编 号：1 0 0 3 1 1 1 1(2 0 0 3)0 6 0 0 0 1 0 4 雌核发育(G y n o g e n e s i s)技术 的原理是将用 人 工 控制的方法使遗传上失 活的精子激活未授精 的成 熟 卵，形 成 一 种 孤 雌 生 殖 的 技 术。He r t wi g(1 9 1 1 年)首 次 在 蛙 的胚 胎 获得 人 工 雌 核 发 育 的证 据。他 发现通过 人 工控 制 的方 法可 以使 精子 的染 色 体 失 活，而 不 损 伤 其授 精 能 力u J。由于雌 核发 育是 单 性遗 传，

4、子 代基 因容 易 纯 合，从而可 以很快 的建立纯 系，而且遗传衰退 比近 亲交配慢得多，因此在遗传育种研究 中具有重要价 值。现在人工诱导雌核发育已经成功 的应用于许多 鱼类和两 栖 类 的育 种，特别 是 在 鱼 类 的育 种 上。Op p e r ma n于 1 9 1 3年提出第一个人工诱导鱼类雌核 发 育 的 证 据。特 别 是 R o ma s h o v 1 9 6 0 年 在 泥 鳅(Mi s g u r n u s f o s s i l i s)获得 人 工诱 导雌 核 发育 二 倍 体 以 来，先 后 在 鲤 鱼(C y p r i n u s c a r p i o)

5、、草 鱼(C t e n o p h a r y n g o d o n i d e l l u s)、大 马 哈 鱼(On c o r h y n c h u s z 业i s s)、虹鳟(0 k e t a)、牙鲆(p a r a l i c h t h y s o l i v a c e u)叫 等 十几 种 鱼类 获 得 人 工 诱 导 雌 核 发 育 的 成 功。贝类 人 工诱 导 雌 核发 育 的研 究 起 步 比较 晚，近 些 年来 的研 究多是用 紫外线 照射精子 获得雌核单倍 体。如 在 皱 纹 盘 鲍(Ha l i o t i s d i s c u s h a n n a

6、 i)t s,6 j、合 浦 珠 母 贝(P i n c t a d a ma r t e n s i i D)【、贻 贝(My l i l u s g a l l o p r o v i n c i a l i s)、太 平 洋 牡 蛎(C r a s s o s t r e a g i g a s)，等 H e r t wi g效 应上 作 了研 究。在 甲壳动物方面，对 中国对虾人工诱导雌核发育也有 过报道。戴继 勋等(1 9 9 3)、蔡难 儿等(1 9 9 5)分 别用。C o和紫外线对 中国对虾(P e n a e u s c h i n e n s i s)的精子 进行 照 射来

7、 诱 导雌 核发 育，并 且都 发 现 了 H e r t wi g效应 的存 在 。但 是 在 海 胆 等 棘 皮 动 物方 面 的 人 工 诱 导 雌 核 发 育 还 尚 未 见 到 过 报 道。本试验对紫外线照射使光棘球 海胆(S t r o n g y l o c e t r o t u s”u d u s)精 子遗 传 失 活，失活 精子 授 精 能力，激活卵子单倍体 的早期胚胎发育等进行 了初 步 研究。1材料 和方 法 1 1 海 胆 的 精 子 和 卯 子 光棘球海胆取 自大连市旅顺塔河湾海区。用 含 KC 1 0 5 mo l L的海水(水温 2 5)浸泡 刺激 亲本 获得精

8、子 和卵子。试验用卵子 的密 度为 1 0 0个 ml，精子则是直接采集 纯的精液。收稿 日期：2 0 0 30 50 6；修回 日期：2 0 0 3 0 6 0 9 作者 简介：高悦勉(1 9 5 4一)男 副 教授 硕士研 究生 导师 学 术带头 人 国务 院政府 特殊津 贴获得 者 维普资讯 http:/ 水 产 科 学 第 2 2 卷 1 2紫外线 的照射和授精 将紫外线 灯 管(1 5 W 2)固定在 照射 箱(4 0 c m 1 5 c m 3 0 c m)的顶 部，底 部 放 一 个 培 养 皿(直 径 8 5 c m)。用 紫 外 线 强 度 计(UR A 一7型)测 得 此

9、处 的 光照 强 度 为 0 7 5 mw(h c m)。精 子 稀 释 液 的选 择：以稀 释 液 中不 运 动 不 消耗 能量，加 入海水后激活为最佳。经选择 试验，稀释 液一般 用林 格氏液效果好。将精液稀释后平铺于培 养 皿 的 底 部。设 照 射 时 间 为 0，4 0，6 0，7 5，8 5，9 5，1 1 0，1 3 0，1 5 0，1 8 0 S共 1 0个 照 射 组。纯 精 液 与 稀 释 液 的 比例 为 1：4，精 液 在 培 养 皿 中 的厚 度 为 0 1 mm。卵子 收集后 要进 行清洗，以免影 响授 精 。照 射后 的各组精 子 与 2 5 0 ml 的卵 液授

10、精。授精后放 置 2 mi n不要 搅 动，授精 卵 沉 积 于底 部 后，倾 去 上 清 液，反 复洗 卵 3次。在水 温 2 22 5，授精 1 0 mi n后 统 计 授精 率；授精 5 h后统 计早期 胚胎 成活率；8 1 0 h后 统 计 幼 虫 的 孵 化 率。1 3精 子 稀 释 液选 择 试 验 试 验选 择 以下 稀 释 液 对 光 棘 球 海 胆精 液进 行 稀 释，观 察 精 子 在 稀 释 液 中 的运 动 情 况。同 时 用 不 同 稀 释 液 稀 释 相 同 时 间(1 5 mi n)后 的 精 子 进 行 授 精，观察授精情况。稀释液种类：生理盐水稀释液(取精制氯

11、化钠 0 9 g，加 蒸 馏 水 至 1 0 0 ml。加 热 煮 沸 1 0 2 0 mi n，冷至室 温 后 加 青 霉 素、氯 霉 素 各 8万 U)、改 良 c o r t l a n d 精 子稀 释 液、精 液保 存 液(葡 萄糖 2 9 g，柠檬酸钠 1 0 g，氯化钾 0 0 3 g，碳酸氢钠 0 2 g，青 霉素和链霉 素各 51 0 U；加 过滤 海水 至 1 0 0 m1)、Ha n k s 液、林格 氏液。1 4染 色 体 的观 察 和单 倍 体 百 分 率 的测 定 染色体 的观 察采 取滴 片法 1 5 J。在 早期 胚 胎 时 期，用 0 0 5浓度的秋 水仙 素

12、处理 3 0 mi n，然后 用无钙 海水 漂洗两次，用吸管吹打胚胎细胞 使其分 散。再用 0 0 7 5 mo l L KC 1 低 渗处理 4 0 6 0 mi n，用卡诺 固定 液 固定，冷滴 片 法滴 片后 进 行 染 色观 察。同时可以计 算单倍 体的百分率，即单倍 体的分 裂相 占总分 裂相的百分率。2 实验 结 果 2 1 He r t wi g效 应 图 1中可见，授精率在 前 9 0 S内呈下降 趋势。但 在 1 1 0 1 3 0 S时 又 略有 回 升，而 从 1 3 0 s 后 随 着 照射剂量 的增加 授精率 的下 降幅度很大。早期胚胎 的成 活率 在 0 9 0 S

13、阶段 随 照 射 剂 量 的加 大 而 迅 速 递减。从 1 1 0 s后 开 始 有 所 回 升，到 1 3 0 s时 达 到 最高值为 6 1，并且 4 0-1 8 0 s实验组 的孵化率均 为零。通过光镜观察，单倍 体最 多可发育至原肠初 期，以后 就不再 发育逐 渐死亡。从图 1的紫外线照 射对 早 期 胚 胎 存 活率 效 应 曲线 中 我 们 便 可看 出 He r t wi g效应 的存 在。89。0 孚 7 0 囊 0 4 0 6 0 5 8 5 9 5 1 1 0 1 3 0 1 5 0 1 8 0 f mi n 图 1 紫外 线 的 照 射 剂 量 对 光棘 球 海 胆 授

14、精 率、早期 胚胎 成活 率的效 应 2 2染 色 体 观 察 通过对 以上结果 的分 析，我们相应 的做 了 4 0，7 5，1 1 0，1 3 0 S 四个试 验组 的染色体观察 实验。由 于 此 染色 体 的制 备 难 度 较 大，得 到 的 染色 体 分 裂 相 不是很 多。但从 表 1的实验 结果 中可 以看 出 1 1 0 S 和 1 3 0 s 两组 的单倍体 百分 率还是有所升高 的。表 1 不 同照射 时 间下光 棘球 海胆授 精率、胚胎 成活 率、单倍体 百分 率等 序 照 射时 间授精 率早期 胚胎 成活 率 单倍体 百分 率孵化 率 m i n 7 f 0 3 9 2

15、2 1 9 5 2 3精 子 稀 释 液 的选 择 表 2的试验结果显 示只在林 格氏液中保 存的精 子 没有被激 活，同时授 精能力很高。5 0 O 0 0 0 0 0 0 7 9 0 6 5 4 4 2 鸲 6 如 8 7 4 1 0 1 2 9 7 5 4 3 4 2 0 啪 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 维普资讯 http:/ 第6 期 高悦 勉等：紫外线照射 对光棘球海胆精 子遗传 失活和授精能 力的影响 表 2 不 同稀 释 液中精 子 的活动情 况和授 精率 3 讨 论 紫外线 照射 使 染 色体 失 活的机 理是 紫 外线 与 DNA 作 用 时，在 同 一 条 多

16、核 苷 酸 链(S i n g l e P o l y n u c l e o t i d e C h a i n)内 相 邻 的 胸 腺 嘧 啶 之 间 相 互 联结，形 成 了胸 腺 嘧 啶二 聚 体(Th y mi n e Di me r s)。此种 胸腺 嘧啶二 聚体阻止 了 D NA 的复制，从而导 致了精子遗传物质 的失活。紫外线照射可诱发突变 和切断染色体，当照射量 达到一定值 以上，染色体 断片脱落，精核萎缩，授 精后虽然雄性原核化，但 不能与雌核融合，不能正常发育，将雌核加倍后 才 能正常发 育形成雌核发育 二倍体。若有断片残存 就 不 能 称 为 雌 核 发 育，所 以适

17、当而 足够 的照 射 量 很 重 要。本次实验所得到的授精率的变化与其它相关实 验有所 不 同，授 精 率 的 变化 也 略符 合 He r t wi g效 应。我们认 为这与实验的对象有关，比如在人工诱 导鲤鱼雌核发育 的过程 中就出现过不符 合 He r t wi g 效 应 的 情 况 u 。在 1 1 0 1 3 0 s 这 一 段 时 间 内 海 胆 的早期胚胎存 活率、单倍 体百分 率均较高，故可在 以后 的加倍试验 中重点推荐。雌核发育人工诱导技术主要 由两部分完成。一 是使精子遗传失 活，授精后可激活卵子，二是染色 体加倍 形 成 雌核 发育 二倍 体。精 子 的失 活 可 以

18、 由 7 一射 线、一 射线、紫 外 线 和 化 学 试 剂 的 作 用 来 完 成，同 时 还 可 以用 异 源 精 子 直接 刺 激 成 熟 卵 子 得 到u 。在 实验的过程 中我 们进 行 了跟踪 观察，在 4 0 9 0 s试验组 中胚胎发育 的畸形率随照射时间的 增加逐渐升高，并且畸形胚胎大多出现在 8细胞期 以后，而且很难继续发育。这可能是 由于低剂量 的 紫外线照射使精子 原核部 分失活所 至。从 He r t wi g 效 应 中 可 以 得 出，1 3 0 s的 照 射 组 为 最 佳 照 射 组，但胚胎只能发育到原肠前 期，只有个别 的发育到 中 期。因此我们推测大连紫海

19、胆雌核发育单倍体不能 发育到 棱 柱幼 虫。同时通 过 实验 对 照组 的 观察 发 现，经 过 照 射 的 精 子 激 活 卵 细胞 发 育 速 度 较 慢 于未 经 照 射 的 对 照 组。适 合 的精 子 稀 释 液 极 为 重 要。适 当 的稀 释 液 可 以很 好 的保存精子，同时还可以避免精子被激活。在鱼 类方面，有 Ha n k s液、淡 水、生 理盐水 等精 子稀 释 液。我 们 通 过 对 照 认 为 用林 格 氏 液 效果 好，照射 时配合以冰降温更好，可不激活精 子，保持其活性 和授精能力，这对实验结果的准确性起着关键性 的 作 用。此次试验 中，染色体 的观察效果 不佳

20、且操作繁 杂，若采用 细胞 流氏仪进 行测定，速度快，准确，效 果 好。参 考 文 献：1 楼 允东 雌 核发 育 及其 在 遗传学 和水 产养殖学 上 的应 用 J 水 产学 报，1 9 8 6，1 0(1)：1 1 1 1 2 8 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 2 由于 海 胆 的 精 子 遇 到 海 水 立 即激 活，所 以选 择 1 3 1 Pur d om Rad i a t i o n i n du c e d gy no ge n e s i s a nd a nd r o ge ne s i s i n f i s h(J He r e d i t y，1 9 6

21、 9，2 4，4 3 14 4 4 Cho u r r o ut The r ma l i n du c t i on o f di p l o i d gy n o ge ne s i s a nd t r i p l o i d i n t h e e g g s o f t h e r a i n b o w t r o u t E J Re p r o d，Nu t r De v e l o p，1 9 8 0，2 0(3 A)：7 2 77 3 3 Re f s t i ePr o du c t i on o f a l l f e ma l e c oh o s a l mo n

22、by di p l o i d g y n o g e n e s i s u s i n g i r r a d i a t e d s p e r m a n d c o l d s h o c k【J Aq u a c u l t u r e，1 9 9 1，2 9(1)：6 7 8 2 Ka t s u t o s h i Ar a i Gyn o ge ne s i s wi t h Ul t r a v i o l e t Ra y i r r a di a t e d s p e r m i n t h e p a c i f i c a b a l o n e J Bu l l

23、 e t i n o f J a p a n e s e S o c i e t y o f S c i e n t i f i c F i s h e r i e s，1 9 8 4，5 0(1 2)：2 0 1 9 202 3 张 国范 皱纹 盘鲍 人工 诱导雌 核发 育精子遗 传失 活 初 步研究 J 海 洋科 学，2 0 0 1，2 5(1 0)：3 73 9 许 国强，林 岳 光，李 刚，等 人 工 诱发 合 浦珠 母 贝雌 和 发育二倍 体发 生 以 及“He r t wi g效 应”的初 步 研究 J 热带 海洋，1 9 9 0，9(2)：1 7 J o h n S e a r

24、p a e t a 1 Gy n o g e n e t i c i n d u c t i o n i n t h e M u s s e l My t i l u s g a l l o p r o r i n d a l is J B u l 1 R e a I n s t A q u a t u r e，1 9 9 4，2 3，3 341 Xi mi ng Gu o Ar t i f i c i a l gy no g e ne s i s wi t h u l t r a v i ol e t l i gh t i r r a d i a t e d s p e r m i n t

25、h e p a c i f i c o y s t e r j Aq u a c u l t u r e。1 9 93，1 1 3，20121 4 蔡 难儿，林 峰，柯亚 夫，等 中国对 虾人 工诱 导 雌 核发 育的研究 I：四步诱 导 法 J 海 洋科 学，1 9 9 5(3)：3 5 41 陈本楠，蔡 难 儿，李 光友 中 国对 虾 人工 诱 导 雌核 发 育的研 究：紫外线辐 射对 精子 顶体 反应和 授精 能 力 的影 响 J 海洋 科学，1 9 9 7(1)：4 1 4 7 戴 继勋，包振 民，张全 启，等 。C oy 射 线 诱导 中国 对 虾雌 核 发育 的观察 J 青 岛海

26、洋 大 学学 报，1 9 9 3，2 3 (4)：1 5 21 5 4 曲丽君 实 验室 中海 胆 的人 工授 精 及 幼体 培 育 J 维普资讯 http:/ 4 水 产 科 学 第2 2 卷 水 产 科 学，1 9 9 9，1 8(5)：2 22 4 1 4 高绪 生，胡庆 明，孙 勉 英 大连 紫 海 胆人 工 育 苗 试 验 J 水产 科学，1 9 9 0，9(2)：1 7 2 0 1 5 胡庆 明，许伟 定，隋锡林，等 大连 紫海 胆染 色体 制 备 的研究 J 水 产 科学，1 9 9 3，1 2(3)：1 1 1 2 1 6 Ko me n，J Du y n h o u w e

27、r，C J J Ri c h t e r e l a l t Gy n o。g e n e s i s i n C o mmo n Ca r p(C y p r i n u s c a r p i o L)I Ef f e ct s o f Ge ne t i c M an i pu l at i o n o f Se xu a l Pr o duc t s a nd I n c u b a t i o n Co n d i t i o n s o f E g g s J Aq u a c u l t u r e，1 9 8 8，69，227 2 39 1 7 潘 锋，胡 玫，王 和 海 异

28、源精 子 诱 导 的 罗 非鱼 人 工 雌 核发 育 J 水 生 生物 学 报，1 9 9 4，1 8，(1)：9 09 1 Ef f e c t of U l t r a v i o l e t o n G e ne t i c I na c t i v i t y a nd Fe r t i l i z a t i o n o f S e a Ur c h i n(S t r o r g y l o c e n t r o t u s n u d u s A)S p e r m GAO Yu e mi a n，SUN Xi a ng s ha n，LI U Xi n (Da l i a n

29、 F i s h e r i e s Un i v e r s i t y，Da l i a n 1 1 6 0 2 3，C h i n a)Ab s t r a c t：S p e r m o f s e a u r c h i n(S t r o r g y l o c e n t r o t u s n u du s)wa s e x p o s e d t o d i f f e r e n t d o s a g e s o f u l t r a v i o l e t a t 0 7 5 mW h c m a n d a t t e mp e r a t u r e o f 2

30、2 Th e f e r t i l i z a t i o n r a t e d e c r e a s e d wi t h i n c r e a s e i n i r r a d i a t i o n p e r i o d d ur i n g e xp os ur e t i me f r o m 0 S t o 1 80 S I n i r r a di a t i on f r o m 1 1 0 S t o 1 30 S，ho we v e r，t he f e r t i l i z at i o n i nc r e a s e d s l i ght l y Th

31、e e g gs we r e a c t i v at e d by t he ge ne t i c i na c t i v i t y s pe r m a nd t h e s ur v i v a l r a t e s of e a r l y e mbr y o wa s 57 0，4 9 0，41 0，20 0，1 2 5，4 8 6，61 0，3 0 5，1 6 0dur i ng v a r i o u s i r r a di a t i o n t i m e，r e s p e c t i v e l y Th e“He r t wi g”e f f e c t w

32、a s f o und o n t he b a s i s o f t h e s ur v i v a l r a t e of e a r l y e mbr y o The e gg s we r e a c t i v a t e da nd de ve l op e d by t he s p e r m wi t h ge ne t i c i n a c t i vi t y a t u l t r a v i ol e t of 0 7 5 mW h c m i n 0 1 m m t hi c k s p e r m f o r 1 30 S Ke y Wo r d s：s

33、 e a u r c h i n(St r o r g y l o c e n t r o t u s nu du s)；s p e r m；u l t r a v i o l e t；g e n e t i c i n a c t i v i t y；“He r t wi g”e f f e c t (责任 编辑：晓荷)省 海 洋 与渔 业厅“十 一 前 组织 大规模 扶 贫 帮 困活动 为贯彻 落实全省扶贫 帮困电视 电话 会议 精神，省海洋与渔业 厅积极组 织厅 机关 和直属 单位在 国庆节 前 开 展 了 一 次 大 规 模 扶 贫 帮 困捐 赠 活 动。共 捐 赠 款 物 6万元，其

34、 中捐 款 5 3万元，捐 物 折 款 7 0 0 0元。这 次捐赠活动厅党组 高度重视，党组 书记、厅 长李洪彦 同志 亲 自主持研 究捐 赠方案，厅 机关及 时 召开捐 赠 动 员 会，对 厅 直 单 位 下 发 捐 赠 通 知，全 面 发 动，积 极 参 与，行 动 迅 速，捐 赠 勇 跃。厅 机 关 在 领 导 率 先 垂 范，带 头 捐 赠 的 带 动 下，捐 款 8 1 0 0元，还 购 置 军 被 5 0床、军 大 衣 5 0件；省 渔 港 监 督 局、省 渔 船 检 验 局、省 水 产 种 苗局、省大连渔政局、省锦州 渔政局、省海 洋水 产研 究所、省 淡水 水产研 究所、省水 产 技术 推广 总站、省 水丰 水库边境 渔政站等厅直单位共捐 款 4 5万元。9月 2 3日，李洪彦、马志佳 等厅 主要领 导亲 自带 队，将捐 赠 的 款物统一送 到厅扶贫点义 县稍户 营子镇 两个重点 帮扶 村，并走访 了重点贫 困户，送 温暖，献爱 心。维普资讯 http:/