土壤中分解尿素的细菌的分离与记数1》(课件).ppt

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1、专题2:微生物的培养与应用微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物 原核生物界 原生生物界真菌界病毒界一、基础知识：(一)微生物 不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气等的要求。二、无菌技术1.无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。（）消毒定义：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）2.消毒与灭菌的概念及两者的区别（2）灭菌的定义：

2、使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而达到完全无菌之过程。1计算2 称量3溶化4灭菌5倒平板操作步骤倒平板技术倒平板技术2、纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法 平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面.在数次划线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术微生物的接种技术微生物的恒温培养微生物的恒温培养稀释涂布平板法土壤中分解尿素的细菌的分离与记数两个主要目的：(1)从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；(2)统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。水生耐热细菌

3、Taq(Thermus aquaticus)耐高温的Taq DNA 聚合酶美国微生物学科布鲁克（T.Brock)1966年发现耐热细菌研究思路（一）筛选菌株尿素分子的立体结构CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3脲 酶分解尿素的细菌:培养基配方KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O 0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。选择培养基选择培养基:从微生物群中选择具有特定表型的细胞.使之进行繁殖所用的培养基,称为选择培养基.加入青霉素的

4、培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物 背景知识测定微生物数量的方法：1直接计数法：最常用显微镜直接计数法。测定微生物数量的方法：背景知识1直接计数法：最常用显微镜直接计数法。先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。测定微生物数量的方法：背景知识优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。缺点：难以计数微小量多的细菌。一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。2

5、间接计数法：最常用稀释平板计数法。（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进行计数。每克样品中的菌株数=(CV)MC：某一稀释度下平板上生长的平均 菌落数V：涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)M：稀释倍数统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。注意：两位同学用

6、稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2.第二位同学在该深度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板菌落数的平均值163作为统计结果。实例1你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？?你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的

7、计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。?因 此，这 两 位 同 学 的 实 验 需 要 改进，在 设 计 实 验 时，一 定 要 涂 布 至 少3个 平 板，作 为 重 复 组，才 能 增 强 实 验的 说 服 力 与 准 确 性。在 分 析 实 验 结 果时，一 定 要 考 虑 所 设 置 的 重 复 组 的 结果 是 否 一 致，结 果 不 一 致，意 味 着 操作有误，需要重新实验。说明设置重复组的重要性。在做本课题的实验时，A 同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其它同学在同样的稀释度下只选择

8、出大约50个菌落。其他同学认为A 同学的结果有问题。他们分析可能是A 同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。实例2但是，A 同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A 同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。你能通过设置对照，帮助A 同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。一种方案：可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A 同学一致，则

9、证明A 无误；如果结果不同，则证明A 同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案：将A 同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。湖南长郡卫星远程学校2009年上学期 制作 031要将从土壤中提取的自生固氮菌与其他的细菌分离出来，应将它们接种在（）A加入氮源和杀菌剂的培养基上 B不加入氮源和加杀菌剂的培养基上C加入氮源，不加杀菌剂的培养基上 D不含氮源和杀菌剂的培养基上D做一做湖南长郡卫星远程学校2009年上学期 制作 032将圆褐固氮菌接种到彻底灭菌的固体培养基上，经过一段时间培

10、养，就能够得到（）A菌丝 B无一定形态的群体 C单个细菌 D菌落D湖南长郡卫星远程学校2009年上学期 制作 033在接种操作的过程中，不正确的是（）A要将接种环灼烧灭菌 B取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌C将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位 D接种后还要将管口灭菌加塞C湖南长郡卫星远程学校2009年上学期 制作 034高压蒸气灭菌的原理是（）A高压使细菌DNA变性 B高温使细菌蛋白质凝固变性 C高温烫死细菌 D高温使细菌DNA变性B湖南长郡卫星远程学校2009年上学期 制作 035、尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时（）A葡萄糖在培养基中含量越多越好B尿素在培养基中含量越少越好C尿素分解菌有固氮能力，故培养基中尿素为无机氮D尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为化合态氮D湖南长郡卫星远程学校2009年上学期 制作 031、D 2、D 3、C 4、B 5、D