DB65∕T4640-2022 胡杨雌雄株分子鉴定技术规程(新疆维吾尔自治区).pdf

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1、ICS 65.020.01CCS B 60B65新 疆维吾 尔自治 区 地方 标 准DB 65/T 46402022胡 杨 雌雄 株分 子 鉴 定技术 规程Technical code of practice for molecular identification of male and female Populus euphratica2023-04-20 发布 2023-06-20 实施新 疆维吾 尔 自 治区 市场 监督管理 局 发 布DB 65/T 46402022目 次前 言.II引 言.Ill1 范 围.12 规范 性引 用 文件.13 术语和定义.14原 理.15 试剂与仪器.

2、16 检测方法.3附 录A（规范 性）试剂 配制.4附 录B（规范 性）胡 杨叶 片DNA 的 提取.5附 录C（规范 性）用于 扩增 胡 杨 雌雄共 有DNA分 子标 记（FM）和 雄 株 特 有DNA分 子标 记（FF）的 引 物 6 附 录D（规范 性）扩增 胡 杨 雌雄共 有DNA分 子标 记（FM）和 雄 株 特 有DNA分 子标 记（FF）的PCR 条件 7 附 录E（资 料性）胡 杨 雌雄 株分 子 鉴 定 结 果 登记.8参 考文献.91DB 65/T 46402022前 言本文件 按照GB/T 1.1-2020 标准化 工作 导则 第1 部分：标准化 文件 的结 构和 起草规

3、则 的规 定 起草。本文件 由 塔 里 木大学提出。本文件 由 新 疆维吾 尔 自 治区 林业和 草原 局归口 并 组织 实施。本文件 起草单位：塔 里 木大学、浙江师 范 大学、新 疆维吾 尔 自 治区 标准化 研究院、新 疆生产 建 设兵 团林业和草原工作总站。本文件主 要起草人：李志军、吴 智华、胡 小明、焦培培、张山河、葛 廷 进、柴政、陈向向、翟军 团、韩晓莉。本文件 实施应 用中 的疑问，请咨 询 塔 里 木大学。对本文件 的修 改意 见 建 议,请反 馈至 新 疆维吾 尔 自 治区 林业和 草原 局（乌 鲁 木 齐 市 黑龙 江 路69号）、塔 里 木大学（阿 拉尔市 虹 桥南

4、路705号）、新 疆维吾 尔 自 治区 市场 监督管理 局（乌 鲁 木 齐 市新华南 路167 号）。新 疆维吾 尔 自 治区 林业和 草原 局 联系电话：0991-5813240；传 真：0991-5580237；邮编：830000塔 里 木大学 联系电话：0997-4680643；传 真：0997-4680643；邮编：843300新 疆维吾 尔 自 治区 市场 监督管理 局 联系电话：0991-2818750；传 真：0992311250；邮编：83000411DB 65/T 46402022引 言本文件 的发 布机构提 请 注意，声明 符合 本文件 时，可 能 涉及到6.2、6.3和6

5、.4中相应内容的相关专 利 的使 用。本文件 的发 布机构对于 该专利 的真 实性、有效性和 范 围无任何 立 场。该专利 持有人 已向 本文件 的发 布机构承 诺，他 愿意同任何 申请人 在合 理且 无歧 视的 条款和 条件下,就专利 授权 许可 进行谈判。该专利 持有人 的 声明已在本 文件 的发 布机构备案。相关信 息可以 通过以下 联 系方式 获得：专利 持有人 姓名：塔 里 木大学、中南 民族大学。地址：新 疆维吾 尔 自 治区 阿 拉尔市 虹 桥南 路705号、湖北 省 武汉市洪山区 民族大 道182号。请 注意 除上 述专利 外，本文件 的 某些内 容仍可 能 涉及专利。本文件

6、的发 布机构不 承担 识别专利 的责 任。IIIDB 65/T 46402022胡杨雌雄株分子鉴定技术 规程1 范 围本文件 规 定了 胡 杨QPopulus euphratica Oliv.）雌雄鉴 定 的PCR 方法。本文件 适用于任何 生长阶 段 胡 杨植株 的雌雄鉴 定。2 规范 性引 用 文件下列 文件中 的内 容 通过 文中 的规范 性引 用而 构成本文件 必不可 少 的 条款。其中，注日期的 引 用 文件,仅 该 日期对应 的版 本 适用于 本文件；不 注日期 的 引 用 文件，其 最新 版 本（包 括所有 的修 改单）适用于本 文件。GB/T 6682分 析实 验 室 用 水

7、规 格和 试验 方法GA/T 383 法庭科学DNA 实 验 室检 验规范3 术语和定义下列 术 语和 定义 适用于 本文件。3.1雄 株 特 有DNA分 子标 记male specific DNA marker通过生物信 息学 等 方法分 析 获 得 的一 段 胡 杨 雄 株 特 有 的DNA 序列片段。3.2雌雄共 有 DNA 分 子标 记 male and female shared molecular DNA marker通过生物信 息学 等 方法分 析 获 得 的一 段 胡 杨 雌雄共 有 的DNA 序列片段。3.3雌雄鉴定方法sex identify利 用胡 杨 雄 株 特 有 的

8、DNA分 子标 记和 雌雄共 有 的DNA分 子标 记 检测 胡 杨 雌雄的 方法。4原 理4.1利 用PCR 技术，对 胡 杨 雄 株 特 有DNA 序列 片 段和 雌雄共 有DNA 序列片段进行 扩增，电 泳检测PCR 扩增产 物，根据扩增产 物电 泳条带 鉴 定 胡 杨 的雌雄。5 试剂与仪器5.1 试剂5.1.1 纯 水。水 的质量要 求按照GB/T 6682 执 行。5.1.2 Taq PCR Mix 预 混液（2X,含蓝染料）。5.1.3 GoldView 核 酸 染料。DB 65/T 464020225.1.4 DNA Marker（Trans DL2000）5.1.5 琼脂糖（

9、分 析 纯）。5.1.6 无水乙 醇（分 析 纯）。5.1.7 异丙 醇（分 析 纯）。5.1.8 氯仿（分 析 纯）。5.1.9 异戊 醇（分 析 纯）。5.1.10三 羟甲 基氨基 甲 烷（Tris 碱）（分 析 纯）。5.1.11 浓 盐酸（分 析 纯）。5.1.12 Na2EDTA 2H20（分 析 纯）。5.1.13 NaOH（分 析 纯）。5.1.14 NaCl（分 析 纯）。5.1.15 0-疏 基乙 醇（分 析 纯）。5.1.16 聚乙 烯毗咯 烷 酮（PVPP）（分 析 纯）。5.1.17十六 烷基三乙 基浪化 镀（CTAB）（分 析 纯）。5.1.18乙酸钠（分 析 纯）。

10、5.1.19 液氮。5.1.20 1 mol/L Tris-HCl 溶液（pH=8.0）（具体制 备方法应 符合 附 录A 的要 求）。5.1.21 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH=8.0）（具体制 备方法应 符合 附 录A 的要 求）。5.1.22 氯仿/异戊 醇（24:1）溶液（具体制 备方法应 符合 附 录A 的要 求）。5.1.23 3 mol/L乙 酸钠 溶液（pH=5.2）（具体制 备方法 符合 附 录A 的要 求）。5.1.24 70%酒精 溶液（具体制 备方法应 符合 附 录A 的要 求）。5.1.25 缓冲 液分为以下两 种（具体制 备方法应 符合 附 录A 的要求

11、）：a）1XDNA 溶 解缓冲 液（TE）0b）50义TAE 缓冲 液。5.2仪器5.2.1 组织研磨 机。5.2.2 高速冷冻 离 心机。5.2.3 核 酸 测定仪。5.2.4 PCR 仪。5.2.5 纯 水仪。5.2.6制冰 机。5.2.7 电 泳仪。5.2.8 水平 电 泳槽及制 胶附件。5.2.9凝 胶 成像 系统。5.2.10 电 子天平。5.2.11 恒温水浴 锅。5.2.12微 量移 液器。5.2.13 磁力 搅拌器。5.2.14 pH 计。5.2.15 高压 灭 菌锅。2DB 65/T 464020226 检测方法6.1 DNA 的 提取采取 胡 杨叶 片，从 胡 杨叶 片中

12、提取DNA。具体 方法应 符合 附 录B 的要 求。6.2 引 物用于 扩增 胡 杨 雄 株 特 有DNA分 子标 记(FF)和 雌雄共 有DNA分 子标 记(FM)的 引 物 序列 应 符合 附 录C 的要 求。6.3 DNA分子标记的扩增及检测用于 扩增 胡 杨 雄 株 特 有DNA分 子标 记(FF)和 雌雄共 有DNA分 子标 记(FM)的PCR 条件，以及PCR 扩增 产 物的电 泳检测方法应 符合 附 录D 的要 求。PCR 操作中 防 止污染 等 注意事 项 按照GA/T 383 执 行。6.4 结果判定6.4.1 通过凝 胶电 泳 结 果(附 录D中 的 图D.1)进行雌雄 株

13、 的判 定：a)同 时出 现胡 杨 雌雄共 有DNA分 子标 记(FM)的 条带和 雄 株 特 有DNA分 子标 记(FF)条带 的 样本 判 定为 雄 株；b)只出 现雌 雄共 有DNA分 子标 记(FM)条带 的 样本判 定为 雌 株；c)两 者 均未出 现为 胡 杨基因 组DNA 提取 失 败 或 空白 对照。6.4.2 胡 杨 雌雄鉴 定 结 果 记 录参 见附 录E。3DB 65/T 46402022附 录A(规范 性)试剂配制A.1 1 mol/L Tris-HCl 溶液(pH=8.0)将24.22 g 的Tris 碱加入160 mL ddlW中充分 搅拌，加入8.4 mL HC1

14、 调pH值 至8.0,加JddlW 定容 至 200 mL,121 高压灭菌20 min。A.2 0.5 mol/L EDTA 溶液(pH=8.0)将37.22 g 的NazEDTA-2H2O力口入160 mL ddlU)中充分 搅拌，力口 固体NaOH 调pH值 至8.0,力口ddHzO 定容 至 200 mL,121 高压 灭 菌20 min。A.3 2%CTAB 溶液将20 g 的CTAB、81.9 g 的NaCL 10 g 的PVP力口入500 mL ddlLO中 搅拌，再力口入 100 mL 的 1 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)溶液、40 mL 的0.5 mol/L

15、EDTA(pH=8.0)溶液，65 水浴溶 解，加 ddfW 定容 至 1000 mL,121 高压 灭 菌20 mineA.4 氯仿/异戊 醇(24:1)溶液将240 mL 的 氯仿、10 mL 的 异戊 醇充分 混匀。A.5 3 mol/L 乙酸钠溶液(pH=5.2)将12.34 g 的 无水NaAc加入20 mL ddlW中 搅拌溶 解，用冰醋酸调pH值 至5.2,力口ddlW 定容 至200 mL,121 高压 灭 菌20 mineA.6 70%酒精溶液将70 mL 无水乙 醇、30 mL ddlLO充分 混匀。A.7 缓冲 液A.7.1 1XDNA 溶 解缓冲 液(TE)将 1 mL

16、 的 1 mol/L Tris-HCl(PH=8.0)溶液、200 nL 的0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)溶液混合后加 ddHzO 定容 至100 mL,121 高压 灭 菌20 min。A.7.2 50 X TAE 缓冲 液将242 g 的Tris、37.2 gNa2EDTA-2乩0加入600 mL 的去 离 子水中 搅拌溶 解，再加入57.1 mL 醋酸充 分 搅拌，用去 离 子水定容 至1000 mL后室温保存。4DB 65/T 46402022附 录B(规范 性)胡 杨叶 片DNA 的 提取B.1 采取 胡 杨植株叶 片1 片，去 掉叶 柄。从叶 片上剪取1 cmX2 c

17、m 的 样品，放入1.5 mL 离 心 管中，以 液氮 速冻保 存。B.2 离 心 管中加入单 颗质量为0.11 g 的钢珠2 颗，在 组织研磨 机中以1400 r/min 磨 样45 s。B.3加入1 mL 已 预 热 至65 的CTAB 缓冲液，之后加入20 uL 疏 基乙 醇，振 荡 混匀，于65 水浴1.5 h,每 隔10 min充分 摇匀1次。B.4 用高速冷冻 离 心机以12000 r/min,4,离 心10 min。B.5取上 清液800 uL 至新的1.5 mL 离 心 管。B.6加入 等体 积的 氯仿/异戊 醇(24:1)溶液抽提两 次(12000 r/min,4,离 心10

18、 min)。B.7取上 清液加入 等体 积-20 预冷 的 异丙 醇、1/10体 积的乙 酸钠 溶液，颠倒 混匀后 置冰 箱冷冻 层(-20)沉淀 2 hoB.8 用高速冷冻 离 心机以10000 r/min,4,离 心10 min。B.9 弃上 清液，然后 用70%乙 醇 洗涤沉淀两 次，弃上 清液，自然风干。B.10 加入100 uL TE 溶 解 基因 组DNA。B.11 用 核 酸 测定仪 检测DNA 浓度，将DNA 稀释到20 ng/u LoB.12-20 C冰 箱保 存备 用。5DB 65/T 46402022附 录C(规范 性)用于 扩增 胡 杨 雌雄共 有DNA分 子标 记(F

19、M)和 雄 株 特 有DNA分 子标 记(FF)的 引 物用于 扩增 胡 杨 雌雄共 有DNA分 子标 记(FM)和 雄 株 特 有DNA分 子标 记(FF)的 引 物见C.1 所 示。表C.1 用于 扩增 胡 杨 雌雄共 有DNA分 子标 记(FM)和 雄 株 特 有DNA分 子标 记(MM)的 引 物DNA分 子标 记 引 物名 称 引 物 序列(5,-3-)FMFM-F TAACCCATCTAACGAGCTTFM-R TGAGTTGAGGAGAAAAGCFFFF-F GACTACAAGAAATAAGCAAACGFF-R ATGCCTCAATCGCAATCT6DB 65/T 4640202

20、2附 录D（规范 性）扩增 胡 杨 雌雄共 有DNA分 子标 记（FM）和 雄 株 特 有DNA分 子标 记（FF）的PCR 条件D.1 PCR反 应体 系PCR 扩增体 系：2XTaq PCR Master Mix 12.5 口L,弓|物（10 Umol/L）各 1 uL,模板 1 uL,力口 ddH20 补足至25 uL。反 应条件：95 预变 性3 min；95 变 性15 s,58 退 火15 s,72 延伸1 min,循 环35 次；72 延伸10 min；4 保 存。检测 过程中分别 设阳 性对照、阴 性对照和 空白 对照。用 已 知雌雄的胡 杨 雄 株DNA 样品作 阳 性对照；

21、胡 杨 雌 株DNA 样品作 阴 性对照；用等体 积的ddlLO代 替模板DNA作空白 对照。D.2 PCR 扩增产 物的电 泳检测称取1 g 琼脂糖，倒入250 mL三 角瓶中，加入100 mL IX TAE 缓冲液，微波炉中加 热1 min 1.5 min 至 溶液沸 腾使 琼脂 完全 融化，50 C 55 时加入2.5 PL GoldView,倒入合 适的胶 槽中，放入 梳子,静置20 min 30 min 待 胶 块完全冷却 拔出 梳子，连 带 胶 槽放入 电 泳槽，电 泳槽中加入IX TAE 缓冲 液 直 至 淹没 胶面。取PCR产 物5 PL（无 需加入6义Loading buff

22、er）,在 琼脂糖胶的胶 孔中依 次加 样。在 电 压为120 V 条件下 电 泳25 min后停 止 电 泳，采用凝 胶 成像 系统进行 检查拍照（图D.1）。FF注1：M：DNA Marker（Trans DL2000）；注2：雄 株 特 有标 记（FF）阳 性样品：2,3,4,6,8,10,12,14,15,16,17,18 胶 孔;注3：阳 性对 照：22 胶 孔；注4：雄 株 特 有标 记（FF）阴 性样品：1,5,7,9,11,13,19,20,21 胶 孔；注5：阴 性对照：23 胶 孔；注6：空白 对照：CK 胶 孔。图D.l PCR产 物电 泳检测 结 果m7DB 65/T

23、46402022附录E（资 料性）胡 杨 雌雄 株分 子 鉴 定 结 果 登记胡 杨 雌雄 株 鉴 定 结 果 登记 如 表E.1 所 示。表E.1 胡 杨 雌雄 株 鉴 定 结 果 登记表样品 编号 雌雄共 有条带（+/-）雄 株 特 有条带（+/-）雌雄鉴 定 结 果（雌/雄）123鉴 定 负责人：8DB 65/T 46402022参 考 文 献1 LI Zhi jun,WU Zhihua,ZHANG Shanhe,LIU Hong,QU Wenrui,QIN Rui,ZHAI Juntuan,HAN Xiaoli.Specific DNA molecular marker for sex identification of Populus euphratica 01iv.Based on bulked-segregant analysis sequencing(BSA-SEQ)analysisP.REPUBLIC OF SOUTH AFRICA:2022/00203,2022-03-30.2 GB/T 26612-2011 纯血马DNA亲 子 鉴 定技术 规程3 GB/T 25876-2010 牛 早期 胚胎 性别 的鉴 定巢式PCR 法9