黄曲霉毒素的测定方法汇总.docx

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1、黄曲霉毒素的测定方法汇总黄曲霉毒素具有较强的毒害作用，可诱发肝、肾、肺、胃等部位的癌变，黄曲霉毒素B1被公认为是目前 致癌力最强的天然物质。药材、饮片及制剂在贮藏、制备、运输过程中，如保 存不当，就会有受潮霉变而污染黄曲霉毒素的可能。因此，各药典都将黄曲霉毒素列为很重要的安全性指 标，中国药典和欧洲药典对多种中药材都都建立了黄 曲霉素检查指标，美国药典对植源性的药品也要求检 查黄曲霉毒素详细介绍中国药典、欧洲药典和美国药典的黄曲霉毒素测定 方法，总结出各药典的差异，并列出详细的检验方法，供各 位参考。1、比较中国药典、美国药典、欧洲药典的检查方法各药典中方法号、限度、适用范围等列表如下，由此可

2、见，各药典收载的检测方法不同、限度不同，最严格的当属欧洲药典。对比内中国药 美国药典欧洲药典摩尔吸收系数(1930m2/niol)。用甲苯-乙月青(98: 2)将初级贮备液稀释为100ng/mL的次级贮备 液，用铝箔紧密包好后，置于4T储存，使用前， 待溶液恢复至室温后才能取下铝箔。使用前后记录 容量瓶的重量。按附表3制备系列对照溶液，将所 需体积的次级贮备液置于250nli容量瓶中，氮气吹 干，加入甲醇75ml溶解黄曲霉毒素B1,并用水稀 |释至刻度。免疫亲和 免疫亲和柱对黄曲霉毒素B1的容量不低于 柱预处理 lOOngo将AFB15ng,溶于12. 5ml甲醇和87.5mL |水中时，回收

3、率不低于80%。使用前平衡至室温。供试品溶 取本品粉末5.00g,加入甲醇：水(70:30)混合溶液 液100ml,超声处理30min,取滤液10ml至150ml锥形瓶，并加入水70nl1。取40nli以流速3ml/min (不得超过5nli/min)通过免疫亲和柱。用水以流 速5ml/min冲洗小柱两次，每次10ml.用注射器注 入空气10s。取甲醇5nli注入小柱，并保持自然流 出，收集洗脱液至5ml容量瓶中，Imin后，注入 甲醇0.5ml,再隔Imin后，注入甲醇0.5ml,每 次加入甲醇后，均通过注入空气收集洗脱液，用水 稀释至容量瓶刻度，摇匀。溶液澄清的话，可直接 用于分析；否则应

4、过滤处理，并确保黄曲霉毒素没有损失。进样量500|i 1定量方法用黄曲霉毒素B1系列对照溶液15做标准曲线，样品浓度超出线性范围，则需要做相应稀释。毒素(|1 g/kg) = (R- b) /a XV/WR二样品溶液的峰面积；b二校准曲线的截距；a二校准 曲线的斜率；V稀释倍数；W二通过免疫柱的供试品 g；黄曲霉毒素的总量是AFG1、AFG2、AFB1和 AFB2的总和。2.4上述方法中的三个附表 附表1黄曲霉毒素M溶剂EAFB1312乙脑20700AFB2314乙庸22500AFG1328乙胞17600AFG233乙睛18900附表2序 黄曲霉素号 对照溶液黄曲霉素工作对照溶液(ng/ml)

5、AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 总和加入量(u 1)附表31000000212. 50. 250. 06250. 250. 06250. 6253250. 50. 1250. 50. 1251. 2545010. 2510. 252. 5510020. 520. 556200414110系列对照溶液加入次级贮备液的体积(|1 1)对照溶液的最终浓度 (ng/ml)11250. 0522500. 135000. 247500. 3510000. 43、注意事项由于黄曲霉毒素的毒性，实验过程必须小心谨慎，总结出4 条注意事项，供大家参考：1、使用真菌毒素对照品，必须穿好防护服，带好手套，在

6、 通风橱内进行，并将工作台盖上胶布。非实验人员未经允 许，不得进入实验室，以免发生意外。2、黄曲霉毒素容易光降解，实验过程需要避光，对照品和 供试品溶液也需要避光保存，线性对照溶液需要临用现配。3、真菌毒素为痕量分析，易受环境污染，应随行进行空白 试验与加样回收率实验。4、用过的玻璃仪器需用次氯酸钠溶液浸泡2小时。2. 8. 18DETERMINATI0N(HPLC 法每1000g含黄曲霉毒素4H go容典依据通则GENERALCHAPTERS2351 真 ARTICLESOFBOTANICALORIGIN 菌毒素测定法方 第 HPLC法 TLC法法法|第HPLC- 薄层扫描法二MS法法第酶联

7、免 HPLC法三疫法| 法 |限度 每 每1000g含黄曲霉毒素B1不1000g 得过5|i g,总量不得过含黄曲 20|i go霉毒素B1不得过总量不 得过10|1 go说明中国药首先使用第一法，第一法系只有一种方法，适用于典的三统适用性不通过才会使用第devil sclawroot,gii种方法二法或第三法。品种需要验证适用性。都可以 使用, 当测定 结果超 出限度 时，采 用第二 法进行 确认。注：总量为黄曲霉毒素Bl (AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1 (AFG1)和黄曲霉毒素G2(AFG2)的总量。2、详解中国药典、美国药典、欧洲药典的HPLC方法黄曲霉毒素检查

8、方法中，唯一同时适用于三家药典的方法, 只有HPLC法(荧光检测器)，而且光化学检测器与HPLC- 荧光检测器配套使用，在线对黄曲霉毒素Bl、G1进行衍 生，不需要任何化学试剂，应用范围较广，因此本文重点比 较此法在各药典中的异同。从以下几部分可以看出，色谱柱、流动相、流速、波长、供 试品和对照品的配制方法、进样量等内容都存在较大差异， 需要谨慎对照使用。2. 1中国药典中黄曲霉毒素检查方法（HPLC法）检验方法_/体内容色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂流动相甲醇-乙月青-水（40： 18:42）流速1. Oml/min|柱后衍生化|光化学衍生器（254nm）检测器荧光检测器，激发波长360

9、nni（或365nm）,发射波长 450nm。系统适用性 两个相邻色谱峰的分离度应大于1. 5；需确认回收 率应在60120%,线性回归的相关系数应不低于 0. 990；混合对照品精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒 溶液素BL B2、Gl、G2标示浓度分别为LO|i g/ml、0. 3|i g/ml、L Op. g/ml、0. 3|i g/ml） 0. 5ml,置 10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶 液。精密量取贮备溶液1ml,置25nli量瓶中，用 |甲醇稀释至刻度，即得。供试品溶液 取供试品粉末约15g （过二号筛），精密称定，置 于均质瓶中，加入氯化钠3g,精密加入70

10、%甲醇 溶液75ml,高速搅拌2分钟（搅拌速度大于 11000r/min）,离心5分钟（离心速度 4000r/min）,精密量取上清液15ml，置50nli量 瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，离心10分钟（离 心速度4000i7min）,精密量取上清液20m1,通过 免疫亲合柱，流速每分钟3ml,用水20ml洗脱（必 要时可以先用淋洗缓冲液10ml洗脱，再用水10ml 洗脱），弃去洗脱液，使空气进入柱子，将水挤 出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2口1 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜 （0. 22|im）滤过，取续滤液，即得。进样量混合对照品溶液5四1、lOpi 1、15|1 1

11、、20H 1、25|i 1；供试品溶液2050口 lo定量方法测定各对照品溶液的峰面积，以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，绘制标准曲线；测定供试品溶液的峰面积，从标准曲线上读出供试品中 黄曲霉毒素Bl、B2、Gl、G2的量，并计算出四者 总和。2. 2美国药典中黄曲霉毒素检查方法（HPLC法）检验方法|具体内容色谱柱 4. 6-mmX 15cm, 3-口 m填料L1 （即十八烷基硅烷|键合硅胶）流动相水-甲醇-乙脯（60:25： 15）流速0. 8mL/min检测器 荧光检测器，激发波长362nm,发射波长440nm系统适用洗脱顺序为AFG2、AFG1、AFB2和AFB1；tt将5号线性对照

12、溶液5nli加入到5g的样品中，按“供试品溶液（甲醇-0.5%碳酸氢钠（7:3）用量为20ml）处理方法，计算AFB1 （2ug/kg）和黄 曲霉毒素（5ug/kg）的平均回收率，应分别不低于68%和70%o AFB1和黄曲霉毒素总量的相对标准 偏差（RSD）不高于10%o免疫亲和免疫黄曲霉素柱的总黄曲霉毒素最小容量不低于柱预处理 100ng。将 AFB1、AFB2、AFG1 和 AFG2 每个 5ng,溶于lOmLlO%甲醇的磷酸盐缓冲盐溶液（v/v）中 时，各回收率不低于80%o对照品溶 用乙睛制备AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别含有 液2. 0、0. 50、2. 0和0. 50

13、 u g/ml的混合对照溶液。首先用乙脂制备标示浓度均为10 u g/ml的各储备 液，在360nm附近测定最大吸光度，计算公式为： 黄曲霉毒素浓度（ug/nd）=（AXMrXIOOO） /,其中A为吸光度，Mr为分子量，为摩尔吸 收系数，见附表1。准确量取一定量黄曲霉毒素各 储备液至同一容量瓶，用乙睛稀释至规定浓度。冰 箱储存，使用前平衡至室温。用甲醇-水（1:1）稀 释黄曲霉素对照溶液，最终浓度见附表2。冰箱保 |存，使用前平衡至室温，每日新制。供试品溶 取样品5g,置于50nli离心管中，加入氯化钠1g液和甲醇-0.5%碳酸氢钠（7：3） 25mLo在涡流混合器上混合，直到样品颗粒和提取

14、溶剂充分混合， 400rpni 振摇 10min, 7000rpni 离心 lOmin,立即取 7mL至50mL离心管中，加入0. 1M磷酸盐缓冲溶液 28mL,混合，过滤，收集251nl滤液（相当于1g 样品）到25ml刻度量筒中，并立即上IAC柱。注：对于IAC柱在使用前必须在室温下至少平衡15分钟。从小柱上取下顶盖，并将其与储液罐连 接。从柱上拆下端盖，并将其连接到柱歧管上（必 须拧紧）。让柱中的液体通过，直到液体高出柱床 约23nlm。将滤液25ml倒入储液罐。让液体自然 流过柱子，让柱子流干。为了便于再次开始流动， 从歧管上取下色谱柱，向柱中加入磷酸盐缓冲盐溶 液约2mL,将色谱柱重

15、新连接到储液罐上，然后用 磷酸盐缓冲盐溶液3ml和水5ml清洗色谱柱（如果 使用其他技术去除柱末端的气泡并很容易重新开始 流动，则可将磷酸盐缓冲盐溶液5ml直接加入到柱 储液罐中）。让柱子流干，然后用注射器注入31nl 空气通过柱子，用甲醇1ml洗脱，并用3nli容量瓶 中收集洗脱液，使洗脱液自由滴落。让柱子流干。 静置1分钟，然后用额外的甲醇1ml洗脱，并收集 在同一容量瓶中。让柱子流干，并注入10ml空气 通过柱子，用水稀释洗脱液至刻度，立即进行分 析。进样量 50H 1定量方法毒素（. g/kg） = （R- a） /S XV/W XFR二样品溶液的峰面积；a二校准曲线的y截距；S二校

16、准曲线的斜率；V二样品溶液的最终体积（mL） ； W二 通过免疫柱的供试品lg; F二稀释系数，V=3mL时为1；黄曲霉毒素的总量是AFG1、AFG2、AFB1和 AFB2的总和。2. 3欧洲药典中黄曲霉毒素检查方法（HPLC法）检验方法|具体内容色谱柱柱长0.25m,直径4. 6mm,十八烷基硅烷键合硅胶为固定相（5” m）流动相|乙脯-甲醇-水（2：3：6）流速1. Oml/min柱后衍生光化学衍生器（254mn）|化|检测器荧光检测器检测，激发波长二365nm,发射波长Aem=435nmo系统适用出峰顺序：G2、Gl、B2、B1；需满足验证要求。性对照品溶用甲苯-乙睛（98： 2）制备10|i g/mLAFBl贮备溶液液，并在330nllT370nli1波长范围内测定吸收曲线，计算公式为：黄曲霉毒素浓度（|1 g/mL）二 （AXMX100）/e,其中A为紫外吸收曲线上的最大吸光度，M为B1的分子量（312g/mol） , 为