实验二银耳多糖含量的测定.ppt

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1、实验二 银耳多糖含量的测定一、实验目的 学习和掌握多糖含量测定的原理和方法。二、简介 糖的定义：也称碳水化合物（carbohydrate），用Cm(H2O)n表示；碳水化合物这个名称并不确切，但因沿用已久，所以至今在西文中还广泛使用。糖是多羟醛或多羟酮及其缩聚物和某些衍生物的总称。糖类的主要生物学作用：是生物体主要的能量来源。可转变为生命所必需的其它物质，如脂类、蛋白质等。可作为生物体的结构物质，如纤维素。可作为细胞识别的信息分子。其它功能。多糖的共同特性 1分子量一般很大，在几万以上。在水中不能形成真溶 液，有的根本不溶于水，如纤维素。2物理性质：有旋光性，但无变旋现象。无甜味。3化学性质：

2、无还原性，不能成脎。多糖（polysaccharide）直链淀粉的空间结构 支链淀粉与支链淀粉的不同在于糖原分子分支多、链短、结构紧密。糖原 糖原糖原 纤维素 不均一多糖 透明质酸 硫酸软骨素 肝素 etc.三、实验原理 多糖在浓硫酸中水解，进一步脱水生成糖醛及其衍生物，与蒽酮（10-酮-9,19-二氢酮）反应生成蓝绿色复合物，在620nm处有最大吸收值。以标准葡萄糖溶液作标准，在620 nm波长处进行比色，可计算出总糖的含量。（1）糖经浓无机酸处理后，脱水生成糠醛或糠醛衍生物；（2）糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸的作用下，能与蒽酮化合物反应生成有色物质。（3）反应液颜色的深浅，反映出糖浓度的高低

3、。四、仪器、试剂与药品 试剂：0.1mg/ml的葡萄糖标准品、蒽酮试剂、蒸馏水 样品液：0.5 mg/ml 试管、电炉、可见光分光度计、容量瓶 etc.五、实验操作 1、标准曲线的制作(1)加样：(2)将加好的样品混匀，沸水浴10 min，室温冷却，于620 nm处比色。(3)以第一管为空白，进行比色。以光密度（OD值)为纵坐标，糖的含量(g)数为横坐标，得标准曲线。葡萄糖溶液(ml)0.00 0.10 0.20 0.40 0.60 0.80蒸馏水(ml)1.00 0.90 0.80 0.60 0.40 0.20蒽酮(ml)3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 2.样品的

4、准备 称取适量样品，先加少量的水溶解，最后定容于50 ml，至溶液浓度约为0.5 mg/ml.3.样品中多糖含量的测定 分别吸取0.1、0.5 和1.0 ml样品液，用蒸馏水补足1.00 ml。加入蒽酮试剂，同标准曲线制作之操作，比色测定。根据标准曲线和样品浓度计算含量。六、思考题 1、根据样品液多糖含量，计算实验一中多糖的提取率。2、根据蒽酮测糖原理，设计测定化合物中淀粉量的方案。注意事项：加样要求准确。实验三 猪胃粘膜中提取胃膜素、胃酶一、实验目的 学习从猪胃粘膜中提取胃膜素、胃酶的原理和方法，了解有机溶剂分级沉淀法的应用。二、简介 胃膜素：功效：一种以黏蛋白为主要成分的生物活性药物，有极

5、强的黏附作用，可直接作用于消化道内壁，在胃及十二指肠溃疡面形成一层保护膜，减少胃酸对它的刺激，利于溃疡面的愈合；另一方面有润滑作用，使进入消化道的食物易于在消化道内移行，有利于减少某些物质对溃疡面的刺激。胃膜素临床上用于胃及十二指肠溃疡。性质描述:淡黄色或淡灰色粉末，或微小颗粒。着水胀为粘浆。显微溶状态，略带类蛋白胨臭。具有很强的粘附力。胃蛋白酶：存在于动物胃液中，以无活性的胃蛋白酶原形式，存在于胃底的主细胞中，在酸性条件下，胃蛋白酶原变化成有消化蛋白质能力的胃蛋白酶。在医学上主要用于治疗消化不良、食欲不振、慢性胃炎等，工业上可作水解蛋白用。干燥的胃蛋白酶为白色或淡黄色粉末，引湿性强，易溶于水

6、；对热较稳定，100 10 min不破坏。水溶液中，70 以上破坏。三、实验原理 胃粘膜一般指胃底粘膜，分泌胃液的主细胞集中在胃底粘膜，呈暗红色，直径约10-12厘米圆块，约100 g。胃膜素是从猪胃粘膜经胃蛋白酶和盐酸消化后的上层液中，60%左右的乙醇所沉淀的部分。蛋白质、酶等极性物质的水溶液加入与水混溶的有机溶剂，可沉淀析出。四、仪器、试剂与药品 水浴锅，搅拌器，冰箱，真空干燥，盐酸，氯仿，丙酮，乙醇，离心机等。四、实验操作 1.激活提取 猪胃粘膜0.55 Kg（5只猪肚）+水约220 ml升（胃粘膜的40%），用1：1盐酸调pH 2.5-3.0，45-50 搅拌提取3 h(在搅拌的过程中

7、需注意不停的调节pH)。2.脱脂分层 双层纱布过滤，冷却至室温，缓慢加入约55 ml氯仿（胃粘膜的10%），搅拌2 h，室温静置24 h后，放掉底层的氯仿和杂质，上清液预冷至5以下 3.胃膜素分离 上清液在搅拌下（同一方向，否则胃膜素会散开）缓缓加入预冷至5以下的丙酮（=0.708）至比重约0.97，捞出胃膜素，以适量的75%乙醇洗两次，真空干燥。4.胃酶的沉淀 母液再加丙酮至比重约0.91，有黄色沉淀产生，离心（4,7000 rpm,10 min)取沉淀，70以下真空干燥。实验四 胃蛋白酶活力的测定一、实验目的 学习和掌握以牛血红蛋白为底物的胃蛋白酶活力测定的原理和方法，掌握紫外分光光度计的

8、使用。二、实验原理 胃蛋白酶能催化水解芳香环氨基酸连接的肽键。在一定条件下，可定量催化水解牛血红蛋白产生不被三氯醋酸（TCA）所沉淀的酚基氨基酸（如酪氨酸）。酪氨酸在275nm波长处有最大吸收，以酪氨酸为对照，可以求出胃蛋白酶活力。三、仪器、试剂与药品 水浴锅，紫外分光光度计，酪氨基，盐酸，三氯醋酸，牛血红蛋白等。四、实验操作 1、对照品溶液的制备：精密称取经 105 干燥至恒重的酪氨酸适量，加盐酸溶液取1 mol/l盐酸溶液65 ml，加水至1,000 ml 制成每1 ml 中含0.5 mg 的溶液，摇匀，备用。2、供试品溶液的制备：精密称取实验三提取的胃酶干粉40-60 mg，用上述盐酸溶

9、液制成每1ml 中约含 0.2 0.4U 的溶液。（称本品（一般3500U/g以上）40-60mg，用上述盐酸溶液定容至100 ml，再取5 ml用上述盐酸溶液定容至50 ml，即0.04-0.06 mg/ml）。3、测定方法：取试管6 支，其中3 支各精密加入对照品溶液1ml，另3 支各精密加入供试品溶液1ml，置370.5 水浴中，保温5 分钟，精密加入预热至370.5 的牛血红蛋白试液5ml，摇匀，并准确计时，在370.5 水浴中反应10分钟。立即精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。另取试管2 支，各精密 加入血红蛋白试液5ml，置370.5 水浴中保温10分钟，再精密加入 5三氯醋酸溶 液5ml，其中1 支加供试品溶液1ml，另1 支加对照样品盐酸溶液1ml，摇匀，过滤，弃初滤液，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，按照分光光度法在275nm 的波长处测定吸收度，算出平均值S 和，按下式计算。每g含蛋白酶活力单位数 s10181.19 式中：S 为对照品的平均吸收度；为供试品的平均吸收度；s 1 ml 对照品溶液中含酪氨酸的量，g；W供试品取样量，g；n供试品的稀释倍数。在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生成1 mol 酪氨酸的酶量，为一个蛋白酶活力单位。