园林植物育种学——生物技术在园林植物遗传改良中的应用.docx

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1、第九章 生物技术在园林植物遗传改进中的应用本章教学目的和要求1 了解园林植物生物技术争论的主要内容。2 把握植物组织培育、基因工程等技术在园林植物遗传育种中的应用。本章教学重点和难点重点：组织培育与基因工程在园林植物遗传育种中的作用。难点：园林植物生物技术的原理与操作方法。教学内容：生物技术 biotechnology 是指依据人们的意愿实行确定的技术手段，直接或间接地利用生物有机体从微生物直至高等动植物或其组成局部器官、组织、细胞等， 进展的生产工艺，制造的生物品种或生物制品的一种科学技术体系。包括组织培育、细胞工程、基因工程、发酵工程、蛋白质工程等。第一节 植物组织培育一、植物组织培育的相

2、关概念植物组织培育 plant tissue culture ：在无菌条件下，将离体的植物材料培育于人工培育基上，并给以适宜的培育条件，使之形成完整植株或生产出具有确定经济价值的生物产品的技术。包括分生组织、输导组织、薄壁组织等离体组织，根、茎、叶、花、果实等各种器官， 细胞、胚、胚珠、子房、胚乳等的离体培育。外植体 explant ： 用于培育的离体材料。继代培育 subculture ： 由最初培育增殖的组织，连续转入的培育基上培育的过程。无性生殖系： 由同一外植体反复进展继代培育后，所得到的一系列无性生殖后代。单细胞无性系： 在细胞培育中，由单细胞形成的无性系。愈伤组织 callus ：

3、 在培育过程中，从植物各种器官、组织的外植体增殖而形成的一种无特定构造和功能的细胞团。胚状体 embryoid ： 由外植体或愈伤组织产生的，与正常受精卵发育方式类似的胚胎构造体。二、植物组织培育的根本程序1 培育用具的预备2 培育基的制备根本成分大量元素、微量元素、有机成分、铁盐、碳源蔗糖、葡萄糖等、凝固剂琼脂、卡拉胶等、植物生长调整剂生长素、细胞分裂素等、其他附加成分活 性炭、 LH 、 CH 、椰乳等、 pH 值3 外植体的选择4 接种无菌操作5 离体培育初代培育、继代培育愈伤组织诱导、不定芽分化体胚再生、增殖培育、生根培育等培育条件、培育方式6 炼苗移栽三、植物组织培育的内容1 植株培

4、育2 茎尖与分生组织培育3 胚培育 embryo culture 4 离体器官培育 organ culture 5 花药与花粉培育 anther & pollen 6 胚珠和子房培育 ovule & ovary 7 胚乳培育 endosperm culture 8 细胞培育 cell culture 9 离体授粉受精 in vitro fertilization 四、植物组织培育在园林植物育种中的应用 快速生殖植物品种、珍稀植物 脱除病毒，培育无病毒苗木 进展种质资源的长期保存和远距离运输 离体诱发和筛选突变体离体辐射或化学诱变；体细胞无性系变异的选择 获得倍性不同的植株花药粉培育获得单倍体；

5、胚乳培育获得三倍体 抑制种子发育和萌发中的障碍兰花种子萌发；胚抢救等 抑制远缘杂交困难离体授粉受精 供给育种中间材料其次节 植物原生质体培育与细胞融合一、概念原生质体：被去掉细胞壁的具有生活力的暴露细胞。原生质体培育：将去掉了细胞壁的暴露细胞培育成植株的技术。原生质体融合细胞融合、体细胞杂交：将不同种、甚至属间细胞人工融合为杂种细胞，并使其再生成植株的技术。二、原生质体培育与细胞融合的方法步骤1 原生质体的制备获得大量有活力的原生质体。 原生质体的分别机械分别法酶解分别法：分别材料的预备离体叶片、悬浮细胞等 酶解果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等2 原生质体的收集与纯化过滤离心法沉淀法 漂移法界面

6、法3 原生质体的活力测定：形态、活性染色、荧光染料活性染色等方法影响原生质体活力的因素： 分别材料的生理状态 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压 分别条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分别持续时间 环境条件：操作环境的温度、分别用具的影响2 原生质体的培育培育原生质体的根本养分同一般组培；对某些组分，如钙和碳源的水平要求更为严格。在培育基中保持确定的渗透压极为重要。常用的培育基有： MS 培育基、 N-T 培育基、 B5 培育基等。留意原生质的湿度及培育时的温度和光照。培育方法：固体培育法；浅层液体培育法；双层培育法 3 细胞融合1 原生质体融合PEG 法、电融合法、

7、高 pH 高浓度钙离子法、 NaNO 3 法等； 2 杂种细胞的筛选突变细胞遗传互补选择法养分互补选择法依据原生质体特性差异的机械选择法3 体细胞杂种植株的鉴定形态学方法、细胞学方法，同工酶法，分子标记法等。融合体的类型：对称融合 非对称融合三、原生质体操作在育种中的应用 培育品种 制造种质 抑制远缘杂交不亲和、杂交不育等障碍 作为基因工程的良好受体 进展突变体筛选的优良原始材料第三节 植物基因工程一、植物基因工程的概念及其争论概况植物基因工程 plant genetic engineering 是指依据人们的意志，通过确定的程序，将具有遗传信息的 DNA 片段，在离体条件下，用工具酶加以剪切

8、、组合和拼接， 再将人工重组的基因，引入适当的植物受体中进展复制和表达的技术。1972年，构建第一个重组 DNA 分子。1983年，世界上获得首例转基因植物。1985年，创立叶盘法进展植物的遗传转化。迄今，已成功获得大量的转基因植物，园林植物包括矮牵牛、金鱼草、菊花、非洲菊、 香石竹、满天星、月季、百合、唐菖蒲、郁金香、仙客来、石蒜、水仙、花叶芋、吊兰、 长春花、南非菊、风铃草、半边莲、六出花、夏堇、草原龙胆、蔓陀罗、长寿花、秋海棠、蝴蝶兰、石斛、结缕草、高羊茅、山茶、连翘、杜鹃花、杨树、桉树、刺槐、美国枫香、 欧洲白桦、挪威云杉、松类等。二、植物基因工程的一般程序与方法1 目的基因的分别与克

9、隆PCR 技术转座子标签技术基因组相减技术cDNA 差异显示技术等2 植物表达载体的构建1 启动子的选择组成型启动子： 35S特异性启动子：组织特异性、诱导特异性2 终止子3 选择标记基因： npt-II 、 hpt 、 bar 等3 植物的遗传转化1 农杆菌介导法2 基因枪法3 花粉管通道法4 其他方法： PEG 法、电激法、显微注射法、激光法、脂质体法、超声波法、真空浸润法、碳硅纤维介导法4 转化细胞的筛选及转基因植物的鉴定1 转化体的筛选抗性筛选：利用选择标记基因利用报告基因： GUS 、 GFP 2 转化体的鉴定PCR 检测Southern 杂交Northern 杂交Western 杂

10、交5 转基因植物的安全性评价与商业释放二、基因工程在园林植物育种中的应用1 植物基因工程育种的优点 从基因水平上修饰植物的遗传物质，定向改造植物的遗传性状，提高了育种的目的性和准确性； 打破物种之间的生殖隔离障碍，实现了基因资源在生物界的共享，大大地扩展了育种的范围； 在很大程度上缩短了育种周期。2 基因工程在园林植物遗传改进中的应用 修饰花色 改进花型 增加花香 延缓年轻 延长花期 转变株形 制造不育 提高抗病虫力气 改善抗逆性 抗除草剂 改善生长特性 治理环境污染第四节 分子标记及其在育种中的应用一、常见 DNA 分子标记技术基于 DNA-DNA 杂交的 DNA 标记： RFLP基于 PC

11、R 技术的 DNA 标记： RAPD 、 ISSR ； SSR 、 SCAR 基于限制性酶切和 PCR 的 DNA 标记： AFLP 、 CAPS基于单个核苷酸多态性的 DNA 标记： SNP 1 RFLP 标记限制性片段长度多态性 Restriction Fragment Length Polymorphism 1 工作原理：由于单碱基的替换、 DNA 片断的插入、缺失、易位、倒位等，引起同源DNA 序列上限制性内切酶的识别位点或位点间的 DNA 区段不同，从而导致酶切片段的多态性。2 根本程序：酶切电泳后转膜预杂交 / 杂交放射自显影。3 特点：共显性标记，不受显隐性、环境和发育阶段的影响

12、；多态性丰富，重复性稳定性好。试验过程中需对探针进展标记，操作繁琐，耗时费力； DNA 需求量大。目前已较少使用。2 RAPD 标记随机扩增多态性 DNA Random Amplified Polymorphic DNA 1 工作原理：利用一系列不同的随机引物 9-10 bp 对所争论物种的基因组 DNA 进展扩增，模板 DNA 序列上引物的结合位点不同，导致扩增产物 DNA 片段的多态性。2 根本程序：引物筛选 PCR 扩增琼脂糖凝胶电泳谱带分析。3 特点：操作简洁易行，一套引物可用于不同物种的基因组分析；多态性高，所需 DNA 量少。显性标记，不能区分显性纯合和杂合基因型；试验结果易受试验

13、条件的影响，重复性较差。应用较多：品种分类、种质鉴定、遗传多样性分析等。 3 SSR 标记微卫星简洁重复序列 Microsatellite Simple Sequence Repeats 1 工作原理：以 2-6 个核苷酸为根本单元的简洁串联重复序列称为微卫星或简洁序列重复； SSR 座位两侧具有保守的单拷贝序列，不同物种或品种，所含 SSR 各异重复次数不同2 根本程序：设计特异引物 PCR 扩增聚丙稀酰胺凝胶电泳多态性分析。3 特点：操作简便，稳定牢靠；具有大量的等位差异，多态性格外丰富。依靠 SSR 的克隆和测序设计引物，开发本钱较高。应用前景好：遗传作图、种质鉴定、品种分类4 AFLP

14、 标记限制性扩增片段长度多态性 Amplified Fragment Length Polymorphism 1 工作原理：通过对基因组 DNA 酶切片段的选择性扩增来检测 DNA 酶切片段长度的多态性。PCR 与 RFLP 相结合的产物。多态性来自酶切位点和其后的选择性碱基的变异。2 基 本程序：总 DNA 酶切，寡聚核苷酸连接头的连接 PCR 扩增聚丙稀酰胺凝胶电泳检测。3 特点：具有 RFLP 的牢靠性和 PCR 的高效、灵敏性；一次反响能扩出 50 100 条谱带， 具有丰富的多态性。需对引物进展标记，相比照较费时耗财。目前应用不多。二、分子标记在育种中的应用 种质资源及遗传多样性分析 利用分子标记进展基因定位 构建分子遗传图谱 资源评价与品种鉴定 分子标记关心选择本章思考题：1 植物组织培育在园林植物育种中的作用有哪些？2 结合实例谈谈园林植物基因工程改进的应用前景。3 常见 DNA 分子标记的种类及其工作原理。