分子生物学试验-实验室日常小集锦.pdf

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1、实验室日常小技巧集锦实验室日常小技巧集锦 平时在实验室最常听到的一句话就是“今天某某试验没做好是为什么？今天某某试验没出结 果是什么原因？今天某某试验为什么会是这样的呢？”等等。然后仔细一查找原因，往往是 由于操作上面的不认真，或是一些小小的细节没有注意到。以下是集各路朋友的一些经验，与大家分享：1跑page胶的时候，小电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形。低电压泳道会 比大电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分离。2.提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因 素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是37度温

2、箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶切很好。3.做WESTERNBLOT 的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间 等等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大 量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将 PVDF 膜晾干，裁减成小块，保存起 来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。4.有关缓冲液和培养基配置有关缓冲液和培养基配置1）将缓冲液配方中的成分分别以10100倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液 混合，补加水稀释即可2）配培养基时通常会忘记各成分的量，如配LB时的三个成分不记得到底

3、哪个是5g，哪个 要10个，因此可以在常用的试剂瓶的标签上注明所需的量，如配LB时，在 NaCl瓶外注明10g/L,yeast5g/L,tryton10g/L 等，很方便，不需要每次配之前临时翻书5.有关有关PCR 主反应液配置主反应液配置:在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行PCR鉴定，每次配置PCR反应液很繁琐，可以将其配置类似kit的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大100倍配置100主反应 液（100次反应），其中含buffer，Mg2，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10分 装或一管储存在20 度，在需要的时候拿出融开，然后按所需的PCR反应个数吸取相应的 倍数，

4、再补加相应反应倍数的Taq和引物，混匀后分装，这样做的好处如下：1）可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球2）避免每次反应加样不均的可能3）大大减少PCR假阳性的产生6.有关酶切反应液的配置:在做酶切时，也可以象PCR一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要 的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入 buffer、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒DNA的体积分装，然后再在每管中加入相应体积的质粒DNA酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有10 几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显：1）各反应成分均一2）可大大减少限制型内切酶的使用3）节省时间7.有关SDSPAGE：

5、1）可将SDSPAGE的积层胶，分离胶预先配好大体积如100ml储存在4度冰箱（注：10AP，TEMED 不加，切记！），每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入 AP，TEMED即可，没必要每次制胶时候翻分子克隆，特别方便，而且，这样的预制胶可储存半年以上，不失为偷懒的绝佳方法；更关键的是可大大减少与丙稀酰胺的接触，因此大大减少中毒的机 会。2）电泳时虽然小电泳分离效果要好一些，但2小时以上的等待的时间实在是痛苦，因此可 以提高电泳至150V，但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热，这样跑出来的胶分 离效果丝毫不比低电压来的差，关键是时间大大节省，不需1h 即可看结果了8.实验中小窍门我想

6、能够分成两类：一类是一类是“非常规非常规”操作操作；一类是常规操作过程中一些省；一类是常规操作过程中一些省 时省事手段。时省事手段。前一类，我举个例子：有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大（12毫米以上，BL21就长得快），下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一 块菌苔（勿带出培养基），50微升酚/氯仿悬浮菌体，放置两分钟，加40微升TE抽提，上 层TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上层TE即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电 泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的培养步骤，至少节省68小时的时间。但是，要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切的效

7、果，不同的实验室或者操作者未 必能够很方便地重复其实，其它的一些“小窍门”也是如此。后一类的小窍门则在实验室中无处不在。如：平行作不同样本的PCR,模板 DNA 加量一样，配置PCR体系可以一起配制后分装这点做过试验的都知道，但是配制的时候配制量可以 比预期分装量稍多一点（如用100微升则配110微升），这样可以避免有时候分装不够的尴 尬，因为不同特别是大小不同的枪，会有误差。再比如：楼上有站友说的sdspage 胶预配（APS和TEMED、或者后者先不加）的问题，实际上时间放置过长肯定影响效果，如果要在一天 内连续地跑两次板，何尝不可？又比如，配sdspage胶的时候，上层胶和下层胶可以只用

8、一 个大枪头：先取胶，次取水，取6.8的tris后再取8.8 的tris，省时省料。20021108站友开的这个帖子很好，在上上层楼的帖子说得也有道理。但我想，“窍门”和“偷 懒”不应该是因果关系。其实，不管是那一类的小窍门，都是在充分地理解实验各步骤的原 理、经过多次试验积累、再加上一点点思索然后尝试的结果。知其然知其所以然和勤于思考 敢于探索，是根本。否则，别人的小窍门对你也未必能够有用。才进实验室的新手，务必要 先练好规范扎实的操作，然后才能弄“窍门”。本末倒置，贻害无穷。9.我一直是把SDSPAGE的积层胶，分离胶预先配成mixture，APS制胶时加入，半年内 使用，绝对没有问题，我

9、保证。10.做SDSPAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳 道之间的band 能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。做法就是拿 1X的上样缓冲补 全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的。11.在把蛋白胶做成干胶时，很多时候会因为有气泡使胶裂掉，我的经验是在做胶时加上层 膜前在胶上多加些水就不容易进气泡了，还有就是高温烘胶，我喜欢放到60度烘箱里烘，这样水分蒸发速度快，即使有一些小的气泡也不会有影响，呵呵，这是经验之谈，我从来都 没失手过，大家可以试试12.做大肠表达时确定蛋白是否表达一般要煮样做诱前诱后检测,但很多时候煮

10、出来的很黏 影响跑胶效果.我发现如果现用 8MUrea重悬细菌再煮效果会有极大改善.注:不能用GuHCl代替13.我也推荐几个偷懒的方法偷懒的方法1 做SDSPAGE跑胶通常都是现配现用,但配胶要1h,所以如果想第二天睡个懒觉而又不耽 误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分离胶,待凝聚后不要拔下梳子,把含胶玻璃板从制胶 槽取下,用保鲜膜包上,注意玻璃板上下两边缘会有气体,所以需要加一点电泳缓冲液以避免 胶内水分蒸发.然后放 4 度过夜.第二天直接拔下梳子行后续.国外好多公司出售脚既是如此,可以保存上星期.2 配置分离胶或者非变性胶时因胶凝时收缩可导致加样孔变浅.可以将加剩的胶放入4度以 降低凝聚

11、速度,而将凝胶放入37度促聚,并随时用4度加剩的胶补充下降的胶面.另外将胶横 放与水平面成10度角也可以减少收缩的影响.3 推荐一个节约抗体/时间的做法:同时跑 2 块胶,同时转膜,然后两块膜背靠背放入同一封口膜同时封闭,同时一抗二抗(最好是 用转轮,这样效果好.如果是摇床,隔一段时间帮它们翻个身以保证两张膜的正面都有机会与 液体充分接触.一起洗膜(可以稍微加强洗膜也可以不做.我最多一张盘子里放 4 张膜而没有 影响洗膜).可分别或同时压片.这样就可以节约一半抗体和接近一半时间而不会影响结果.或者另外一个就是孵育后的抗体不要扔,好的抗体可以反复做好几张膜呢.但每次都会减弱,效果不如上面一种方法

12、.14.做westernblotting 转膜转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇的缓冲夜中 缩小的差不多后装 好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染maker条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染maker很清楚，等转膜后就不是分辨的很清楚 了。不过要注意画好预染maker后就不要使胶和膜发生对位移动了，以防maker失去参照价 值。15.超滤最合适用于蛋白的浓缩，更换缓冲液和除盐，对于按照分子量进行初分离的效果不 是很好，理论和现实是有很大差别的_16.关于关于WesternBlot1）器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可以

13、先用中性 洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗23遍，然后用去离子水冲洗一遍。最后用95酒精再擦一遍后晾干备用。2）配胶最好现用现配，先配下层胶（分离胶），后配上层胶（浓缩胶或积层胶），而且在临 灌胶前加APS并迅速混匀，即用移液枪抽吸与注入12次即可。17跑蛋白page的时候，一开始用加样针，太麻烦，发现用20ul枪+普通小白枪头点，非常 省事。另外，点样时有可能看不清孔在哪，看远离你的那面胶，孔有反光的。点样也点你对 面的那块胶，省的总低头，干咱这行的容易得颈椎呀，爱惜自己。18.垂直电泳时，可在电泳糟中放入青霉素小瓶等，可自然使液面提高而不影响电泳，又很 节约电泳缓冲液。

14、19.我们有时要沉淀东西时，由于沉淀量很少，离心完之后不知道到底有没沉淀下来东西，由于量很少，不好观察，所以离心时建议按特定的方向放置离心管，这样你就可以在离心之 前确定沉淀该沉淀到管子的大致部位，这样离心后就可直接观察那有没有沉淀，避免满管子 找，另外看沉淀时可以对光看，这样就是颗粒状的细小沉淀也能看见的。20.大家都知道 PMSF 有剧毒，以前都是知道浓度和要配的体积的基础上,算出要称多少毫 克的PMSF,其实也可以先称PMSF,称多少算多少,再调整异丙醇的体积，到达你所要的浓度。这样就避免了你长时间和它接触。21.跑好跑好SDSPAGE 胶的一些体会。胶的一些体会。1.清洗好玻璃板，不要

15、偷懒，很多时候跑完电泳撬胶时会因为玻璃板不干净胶粘在板上把 胶撬破。2.配胶时不要反复用枪混，稍微摇混就可以了，用枪混多次会导致胶凝不好影响电泳图的 分辨率。3.AP分装成500微升一管保存放20度，避免AP用太久失效。4.倒胶时把玻璃板中的水用滤纸尽量吸干，因为微量的水存在会影响配的胶浓度。5.尽量不用过夜放室温或者四度的胶，也回影响胶 的分离效果。6.电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，在一平皿里装好水，把有胶一面的放在水中晃动几 次胶很容易就脱落下来，一点没有问题，方便的很。7.点样时样品别忘了离心这步，因为上样含有固体沉淀会影响电泳图分辨效果。8.尽量在冰浴状态下跑。22.做做的比较多，总

16、结了几个小窍门：做做的比较多，总结了几个小窍门：一向电泳时，盐离子容易聚在 胶槽的两侧剪一小段胶条放在 两侧，构成 盐桥，电压就容易上去了避免一向电泳不好影响最后实验 结果 SDSPAGE时,在灌胶之前,一般大家都会用凡士林封底,在SDSPAGE电 泳之前又必须把凡士林搽干净,很是麻烦,我的经验是:不用凡士林,取少量未加Ap的分离 胶,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板间,等上几分钟,待胶凝固后就可以接着灌分离胶了.方面,效果好!23.蛋白质纯化时，蛋白质降解可能与超声破菌保持冰浴有关，之前建议加pmsf，建议在上 柱子洗脱的时候也加pmsf（蛋白降解抑制剂），一定要用之前再加。24.做透析的时

17、候，拿一个5ml的枪头或者是其他类似的东西，剪短，穿过个塑料泡沫之类的面积比烧杯大东西，然后把透析带一端扎紧，另一端开口绑紧在 5ml 枪头下端，扎紧得 那端也可以弯过来绑成u字型。这样就可以用1ml的枪穿过5ml的枪头的孔，另一只手调 整透析带，来加样取样，省去了总绑透析带的麻烦，对同一个蛋白大量多次透析非常方便25.第一次发贴说一下自己的小经验，希望版主能给我一分，每次看到好东西因为没分都没 法下，好羡慕有分的人啊。当然也不能不劳而获，说一下自己的实验技巧给大家分享。1.配SDSPAGE胶时，用枪头混匀比较麻烦，而且费时费力，效果也不好。可以剪一小段 夹文件的那种曲针做转子放到配胶的小烧杯

18、里，在磁力搅拌器上边搅边加入各溶液，这样加 完也就混匀了，直接灌胶即可。2.上面的站友也说过，上样用黄枪头就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建议大家也试试。3.电泳后考马斯亮蓝染色一般要1h 到2h，脱色也要2h 左右，麻烦的很。现在给大家说一个 简单的方法，是我从一个师姐那里学到的。加入染色液后，先放入微波炉里加热510秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否 则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5 分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍

19、差一点点，不 如那样清楚，只要电泳时比平时多上 1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着 含甲醇和冰醋酸的脱色液）。方便快捷！放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。26.我也说说我的小经验。可能大家都知道，请别笑话我。1、配胶时一定要掌握好时间，不要因为过度赶时间，而造成以后的条带粗大，压不成条带，且消耗很多试剂和时间。2、加样时，冲洗加样器可用双蒸水，用电泳液会使加样器中有很多的泡沫。或许是因为SDS的原因吧？3、对于大分子蛋白质，转膜过夜更好。滤纸的张数可以适当减少。4、在跑样时同时加入MARKER有助于正确识别所需的蛋白位置，减少 NC膜的消耗。5、一抗、二抗的浓度不要太高。6、做EC

20、L 显影时，根据荧光的亮度调整时间。泡完显影液，胶片应用水洗一下，以减少定 影液变黄。7、和有经验的同学交流，也是非常重要的。知识的交流绝对有助于试验的成功。这是我目前的一点拙见。27.推荐一个省质粒试剂盒硅胶柱与溶液的方法：省质粒试剂盒硅胶柱与溶液的方法：所有试剂使用手提质粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替试剂盒的solution1、2、3），然后一比一的与饱和碘化钾或碘化钠（代替结合缓冲液）混合，就可以让质粒在硅胶上结合，而试剂盒的硅胶柱可以重复使用，没有试剂盒溶液量的限制，只要是一样的质粒我想提几管 就提多少。顺便说一句硅胶柱也可以用自己买的硅胶粉末代替，离心后倒掉硅胶柱上面的上清

21、就可以，用起来不象柱子方便。效果比手提的要好要快。28.做 WB 时,样品比较多,又怕放时间长了对蛋白样品不好,而且确定以后肯定要做某个抗 体,只是一时没有决定.那么你可以选择先做SDSPAGE,并转膜.然后把PVDF膜凉干,放四 度保存.以后拿出来封闭后,加抗体就行了.蛋白在膜上,且已经分离,比保存在 BUFFER 里 面的蛋白肯定更可靠。呵呵29.今天作his纯化的时候，又琢磨了一个窍门，与大家分享。我得样品比较多，几百ml，而柱子不够大，只有10几ml，跑来跑去的上样，还总得记着，太麻烦了。于是，我就刷干 净了一个烧杯，装了我的样品，找了一个细胶皮管，当连通器，就像鱼缸换水一样，用5ml

22、枪在一头一吸，液体流出来，放到纯化柱里，调好烧杯的位置，两个液面一样平了，呵呵，上了好几个小时了，没有问题，现在调低速度，过夜上样：）30.能导致PAGE胶不凝的原因主要有三个：1、配胶中用到的主要试剂的配置。主要就是30的丙稀酰胺的配置。粉末状的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不应该超过一年，因为丙稀酰胺会吸潮水解，这样以来丙烯酸的含量就会加大，从而导致page 胶不凝。2、温度。温度高时凝固快，但是亦不宜过高，因为温度变化会影响交连物的孔径大小。所以温度在25度最为合适。3、氧气。氧气是凝固的终止剂，所以不能让胶中出现气泡。虽然都是些看起来听低级的错误，但是不注意还是会犯。31.我做2维蛋白电泳

23、，也有些心得：1、向电泳玻璃板内加入胶条时，先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要加满，再将胶条 贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘，这样可以很好的避免胶条下形成空 气泡。2、能做出好的图谱已经很不容易了，如果在扫图时撕破实在可惜，所以扫图要小心，将凝 胶转移到扫描仪时可以用塑料隔片在下面托着，同时保持有些水，这样就安全多了。32.凑个热闹说两句吧1、sdspage 胶如果配好装好倒入内槽液以后，发现内槽液稍有渗漏，可以把外槽液多加一 些，加满，加到与内槽液相齐，这样就可以继续正常跑胶，不用浪费已经加进去的内槽液2、至于染色脱色的问题，我们这里一直是染色：加热半分钟，摇20分钟；如

24、果染液不是新 配的，就加热半分钟摇十分钟，凉透了再重复一次即可 脱色也一直是用去离子水煮两三次即可3、不知道大家都是怎么做酶切的，我的体会是，酶切质粒时，两个酶分别单酶切比直接双 酶切效果要好很多。我有一次双酶切两次都没连出来，后来分步单酶切，连接效率几乎 100%。可以第一个酶切完后直接把体系热失活，（根据酶说明书上一般是65度20min）然后直接向 里面补第二个酶或者第一个切完后用氯仿抽提，把蛋白提出 或者中间做一次回收，这个就要考虑回收效率和损失的问题了，但是这样除蛋白最彻底 前两个方法我们这都是有人做过的，已经都很好用了33.俺也来说说关于 Bradford法蛋白浓度定量和法蛋白浓度定

25、量和DTNB法巯基浓度定量法巯基浓度定量的一点体会：我是做蛋白修饰巯基后，通过这两种方法的定量来间接反应修饰的程度。一路摸索过来，也 有半年有余；最大的体会就是不要急于求成，直接实验，首先检测修饰体系是否对方法有影 响，修饰基团是否会在595nm和412nm 下有特定的吸收，修饰后修饰试剂本身是否会有变 化，对蛋白整体结构造成影响，其次再谈具体修饰比例和程度。对于巯基浓度测定方法，有 四种（AnalBiochem.1998Dec1265(1):814），而DTNB本身虽然灵敏度不高，但是重复性 和抗干扰是最佳的了。34.考马斯亮蓝染色后的脱色，如在脱色液中加数张捏成条状的Kimwipes纸（国

26、外实验室 常用，相当我们的擦镜纸，全棉纤维制造），由于染料吸附到纸纤维上，脱色加速。待纸着 色较深时，更换新纸条，不用换液。我想脱脂棉或纱布也是一样的。但滤纸等可能不行，会 溶掉。半贴壁细胞如SP/0或杂交瘤细胞传代时，不用吹打或刮落。先将上清吸出，适当拍打培养 瓶（当然是塑料瓶，玻璃瓶拍碎了别找我），即可见贴壁细胞脱落，加培养基混悬即可。注 意，过力拍打培养瓶会裂，特别是瓶颈。35.一向电泳时，盐离子容易聚在 胶槽的两侧 剪一小段胶条放在两侧，构成盐桥，电压就容易上去了避免一向电泳不好影响最后实验结果36.我也推荐几条：1、关于20021108战友的说法，我觉得我们制备好了一批感受态，最好马

27、上转化一种已知质 粒，与此同时，取一点感受态接种到含抗性的固/液体培养基培养来做对照。这样第二天即 可以知道这批感受态是否还有外源质粒，又可以知道这批感受态转化效率的高低。如果合格，那以后就可以放心使用！因为我也曾经遇到其实是因为感受态不好而导致试验不成功，但是 当时不知道，结果费时费力。2、做克隆挑斑时，我们可以在将沾有菌体的牙签丢到试管前，在一块相应抗性的平板上点 一下，标注清楚，培养时间稍长一点，待长成较大菌落后收取。以后需要哪一个菌,就在平 板上挑取。这样既方便快捷，又可以保证菌的一致。3、抽提质粒时，加入SloutionII 和III 后要求轻柔混匀。我个人觉得不用这样，只要不是非

28、常剧烈，可以快速混匀。尤其可以运用在一次抽提多管质粒的时候，这样可以快速，而且效 果一点也不差。4、抽提质粒时，用无水乙醇沉淀的时间可以由实验操作者来决定，如果时间充裕可以30min，否则810min也可以。至于温度，个人觉得20度好于常温。如果加入可醋酸钠，会较容易 形成盐类杂质，所以时间短一些更好！今天想到这些，先写到这里，以后想到了在上来与大家分享。希望我的小经验对大家有所帮 助！37.首先声明：实验中的一些技巧要用在首先对基本的操作有深刻了解的基础上，在力求省 时、省力、节约成本等的同时，实验的准确性是最重要的。对大多数做蛋白的战友们来说，培养细胞应该是不陌生的，我这里谈一个培养细胞的

29、小技巧，大家知道，对于一定的空间（如某种尺寸的细胞培养瓶）来说，细胞数目太多或者太少都不 利于其生长，太多了就要消化，太少了要换一个小点儿的培养瓶，我的做法是：如果细胞数 目太少，可以不必去找小一点儿的培养瓶，可把原来的培养瓶由原来的平放改为竖着放，这 样底部的空间就小了，有利于细胞的生长，当细胞数目增加到一定程度的时候还可以在平过 来，避免了来回换培养瓶而增加污染的机会（对没有小培养瓶的更实用）。个人体会，仅供参考。38.说说关于SDSPAGE的几个小经验1、做好胶后，把所有的加样孔都加上样，这样可以防止边缘的样品脱尾。2、高电压/高电流电泳时，可以把电泳槽放到4度冰箱中进行电泳，省时省力，1hr搞定。3、胶考染时间40min，放在凝胶摇床上（没有胶床可以放到28度普通摇床上，但要控制好 摇床速度）缓缓摇动，使染色均匀，同时可提高检测的灵敏度，根据我的经验可以达到银染 的级别，就是脱色时间比较长，一般需要脱色23d，夏天的时候要勤换脱色液，防止变臭 哦39.质粒小提如果是用作鉴定或酶切，不必进行酚仿抽提，将溶液1.2.3 离心后的清液移入 一个新的 1.5ml 离心管中，再次离心 35 分钟，小心取出上清液后，直接沉淀，不必担心DNA切不开，我已经这样使用一年多，没出过什么问题。当然这样的质粒不很干净，但是 做鉴定足够了。尤其是实验室女同胞们，可以减少酚仿的侵害，而且节省时间。