土壤微生物鉴定.docx

《土壤微生物鉴定.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《土壤微生物鉴定.docx（10页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 - 好好学习，每天向上土壤微生物的分别与鉴定组员：阚能涛，户红通，郭晓辉，耿静，孔桂慧，兰欣玉关键词：土壤微生物，分别鉴定，生理生化， 试验摘要：土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不行无视的影响。根际微生物与植物的关系特别亲热，不同的土壤和植物对根际微生物产生显著影响，而不同的根际微生物由于其生理活性和代谢产物的不同，也将对土壤肥力和植物养分产生乐观或消极的作用。土壤微生物不仅对土壤的肥力和土壤养分元素的转化起着重要作用，而且对于进入土壤中的农药及其他有机污染物的自净、有毒金属及其化合物在土壤环境中的迁移

2、转化等都起着极为重要的作用。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在 土壤外表，由于日光照耀及枯燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm30 cm 的土层中菌数最多，随土层加深，菌数削减。土壤中微生物以细菌数量最多，为几百万个/克土至几亿个/克土，有各种生理类群，营 养类型多属异养型，鉴别染色多为革兰氏阳性。放线菌含量为几万个/克土至几百万个/克土， 但其生物量不比细菌低，由于菌丝体积较大。土壤中真菌含量为几千个/克土至几十万个/克 土，而其生物量常比细菌的大。酸性土壤中真菌较多。藻类在土壤中的含量不及微生物总 数的 1，生长在潮湿土壤的表层。原生动物

3、在富含有机质的土壤中较多。通过土壤微生物的分别与计数及划线纯化，涂布分别长出的单菌落，须经划线纯化， 再转斜面培育后保藏备用。涂布分别细菌的平板，温箱培育 2d3d 后，于室温下放置 3d 或 2d，使菌落性状表现较充分，然后挑取各单菌落的局部培育物，在预先制备好的平板上划线纯化。到达分别纯化生疏土壤中微生物的目的，并把握各种相关试验操作技术。试验原理：(一) 对土壤中微生物的分别筛选及鉴定从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程成为微生物的分别与纯化，常用的方法有简易的细胞挑取法和平板分别法。-1其中平板分别法操作简洁，普遍用于微生物的分别与纯化，奇迹般原理包括两个方面：（1

4、） 逊则适合于待分别微生物的生长条件如养分，酸碱度，温度或氧等要求或参与某种抑制剂造成只有利于该种微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。（2） 微生物在固体培育基上生长形成单个的菌落可以是由一个细胞生长生殖形成的集 合体。因而可以通过挑取单个菌落而获得一种纯培育，或去掉那个菌落的方法可由稀释涂布和平板划线等技术完成。土壤是微生物生活的大本营，它所含有的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。土壤是微生物多样性的重要场所，是开掘微生物资源的重要基地，可以从中分别纯化得到很多有价值的微生物菌株。 菌株的鉴定的生理生化试验糖发酵与氧化试验在细菌的分类鉴定中，糖类发酵与氧

5、化测定是一项重要依据。特别是对细菌的鉴定尤 为重要。常用的发酵与氧化的糖类包括单糖，双糖，多糖三类：如葡萄糖，蔗糖，淀粉等。醇类包括五元醇，六元醇;如到金盏花醇，甘露醇等；糖苷类主要包括有水杨苷等。绝大多数细菌都能利用糖类作为能源和碳源，但由于不同的菌类存在酶类差异，已而对糖 类发酵与氧化的力气就有所不同。有的能利用这种而不能利用那种，有的正好相反；有的 在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类，产酸产气，有的则只能产酸不能产气。酸产生与否， 以准时发酵类型产酸还是氧化类型产酸，可以由预先加在培育基中的指示剂溴百里酚蓝 水溶液呈现出来。这样把接好菌种的培育基放在厌氧或好样的条件下培育，培育基由绿 色变

6、为黄色为产酸，是否产气是通过观看培育基中是否产生气泡或培育基断裂来测定，如 产生断裂或有气泡证明由气体存在。过氧化氢酶测定乳酸菌和很多厌氧菌与其他细菌区分的主要依据是测定有无过氧化氢酶。过氧化氢酶又称接触酶，它能把过氧化氢分解为水和氧气，氧分子变做气泡跑出来，则为过氧化氢酶阳性。乳酸菌和很多厌氧菌在过氧化氢试验中呈阴性。细胞色素氧化酶测定细胞色素氧化酶是氧化酶中的一种，有时人们习惯的把细胞色素氧化酶称为氧化酶， 所以在细菌分类鉴定中所说的氧化酶就是指细胞色素氧化酶。细胞色素氧化酶在右分子氧和细胞色素C 存在时，可氧化二甲基对本撑二胺(氨基二甲基苯胺)，使之呈现玫瑰红到暗红色，在此根底上，还能和

7、a-苯酚结合生成吲哚酚蓝，而消灭蓝色。试验目的：土壤是微生物生活的大本营，是查找和觉察有重要应用潜力的微生物的主要菌 源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。 一般在较枯燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数 量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次试验从土壤中分别并纯化细菌。 1、设计试验方案，分别目的菌，并通过后续试验做出初步鉴定。学习从样品中分别、纯化 出所需菌株。把握倒平板的技术和几种常用的分别纯化微生物的根本操作技术。2、学习并把握过氧化氢酶测定、细胞色素氧化酶测定和糖发酵与氧化试验的试验原理及其操作方法

8、。3、复习显微镜底倍镜和高倍镜的使用技术，复习油浸系物镜的根本原理，复习其使用方法。4、明确培育基的配制原理。复习配制培育基的一般方法和步骤。复习消毒和灭菌的原理， 复习各种灭菌方法的操作步骤。5、复习、把握细菌稀释分别、划线分别等技术。复习并把握平板倾注法和斜面接种技术， 了解培育细菌的培育条件和培育时间。复习平板菌落计数法。6、复习微生物涂片、染色的根本技术，把握细菌的简洁染色法。复习鞭毛染色、革兰氏染色的根本原理和操作方法。试验过程： 试验器材：1、 培育基：牛肉膏蛋白胨培育基2、 试剂：革兰氏染色液、5%孔雀绿水溶液、%番红、甘油、灭菌水3、 仪器或其他：三角瓶、试管、接种环、接种针、

9、载玻片、酒精灯、涂布棒、移液枪、显微镜、平皿、木夹子等。4、 样品：生命科学院试验田中土壤试验步骤：一、分别与纯化1. 预备将内装 90ml 的蒸馏水和玻璃珠假设干的三角瓶、已配好的培育基、涂布棒、试管内装9ml 蒸馏水假设干、平皿假设干放入高压锅高温灭菌。2. 稀释将土壤样品 10g 参与 90ml 灭菌水中振荡 20 分钟，形成土壤悬浊液，取 1ml 参与装有 9ml灭菌水试管中振荡形成 10-2 稀释，依次将土壤样品稀释 10-3、10-4、10-5、10-6、10-73. 涂布平板将 10-5、10-6、10-7 的稀释样品分别涂布到已制好的固体培育基平板上，每种涂3 个平板。4. 培

10、育将平板置于 37。C 恒温培育三天。5. 分别从平板中挑取单个菌落进展平板划线分别培育，培育2 天，共选了 4 种菌。6. 纯化将划线长出的菌接种于已预备好的固体斜面培育基中。培育2 天。7. 镜检对平板中的 4 种菌分别进展美蓝染色、革兰氏染色、芽孢染色，放在显微镜下观看，并记录结果。8. 保种将长出菌的斜面放入冰箱中保存。二、生理生化试验一 糖类发酵与氧化试验一、器具或材料试管、接种针、恒温箱等糖类发酵与氧化试验培育基半固体 二、操作步骤1、 接种：以移接 1824 小时待鉴定的菌用接种针穿刺接种。接 4 支，其中 2 支用灭菌的凡士林或石蜡洋菜上封盖，以隔绝空气为闭管，另2 支不封为开

11、管，同时要有不接种的闭管作比照。2、 培育：置于 37 度恒温箱中，培育 816 个小时，1 天、3 天和 7 天3、 观看：在上述培育时间内观看试管中指示剂的变化状况三、结果在 8 小时、16 小时检查，假设培育基柱上部变黄，下部仍为绿色，则证明为氧化型，全部变黄或下部变黄上部为绿，则为发酵型。二 过氧化酶测定一、器具与材料试管、培育皿、小滴管、接种环、恒温箱等，3%过氧化氢溶液二、操作步骤1、 接种：将鉴定菌接种于适宜的斜面或固体平板上2、 培育：适温培育 1824 小时3、 测定：取 3%过氧化氢毫升，滴加到不含血红素或红血球的琼脂培育物上，也可取一环培育 1824 小时的菌苔涂在干净的

12、载玻片上，然后滴一滴3%的过氧化氢。三、结果培育物消灭气泡为阳性反响，无气泡为阴性反响三 细胞色素氧化酶测定一、器具与材料华一号滤纸、培育皿、白金丝或火柴棒等。牛肉膏蛋白胨培育基，1%盐酸二甲基对苯撑二胺或盐酸对氨基二甲基苯胺溶液，1%萘酚乙醇溶液二、操作步骤、方法一1、 在干净培育皿里放一张滤纸或滤纸条2、 用白金丝或火柴棒切勿用含铁物质，因遇铁后消灭假阳性取培育 1824 小时的鉴定菌苔粘在滤纸上。3、 在滤纸上菌苔处，加上一滴 1%盐酸二甲基对苯撑二胺或盐酸对氨基二甲基苯胺溶液，进展观看。、方法二1、 用 1%盐酸二甲基对苯撑二胺或盐酸对氨基二甲基苯胺溶液潮湿滤纸2、 再滴加约等量的 1

13、%萘酚乙醇溶液3、 用白金丝接种环或火柴棒榨取约鉴定菌菌苔涂抹在上述滤纸上，进展观看。三、结果方法一：在10 秒钟内涂抹的菌苔呈现红色者为阳性；1060 秒钟呈现红色者延迟反响，也为阳性；60 秒钟以上呈现红色者都不计，按阴性处理。方法二：消灭兰色者为阳性，消灭变色的时间要求同上四、查伯杰氏手册依据菌落形态、染色性质及生理生化性质查分别出的菌为哪几种菌。试验结果记录：1、 菌落特征工程颜色透亮度形态潮湿度边缘隆起程度菌号1土黄色不透亮圆形潮湿整齐扁平2土黄色不透亮圆形潮湿整齐扁平3土黄色不透亮圆形潮湿整齐扁平4灰白色半透亮不规章潮湿不整齐隆起2、 镜检结果工程外形状态革兰氏染色芽孢菌号1杆状链

14、生G-端生2杆状散乱G-无3球妆成片G+无4杆状链生G+端生3、 生理生化试验结果（1） 糖类发酵与氧化试验工程封管不封管菌号培育基柱上 培育基柱下培育基柱上 培育基柱下产气部部部部1黄色黄色绿色绿色无2绿色黄色绿色绿色无3绿色黄色黄色绿色无4绿色黄色黄色黄色无空白绿色绿色无无依据封管推断：1、2、3、4 号菌均为发酵型，且均不产气。（2） 过氧化氢酶测定菌号1234结果结论：1、3、4 号菌有过氧化氢酶，2 号菌无过氧化氢酶（3） 细胞色素氧化酶测定菌号1234结果结论：1、2 号菌含氧化酶，3、4 号菌不含氧化酶4、 查伯杰氏手册结果：1 号菌：细胞杆状，链生，革兰氏反响阴性，有芽孢，端生

15、，代谢为发酵型，过氧化氢酶测定为阳性，氧化酶测定为阳性。查伯杰氏手册估量为杆菌科芽孢杆菌属。2 号菌：细胞杆状，革兰氏反响阴性，菌散乱不成片生长，代谢为发酵型，产酸不产气，过氧化氢酶测定为阴性，氧化酶测定为阳性。查伯杰氏手册为弧菌科弧菌属。3 号菌：细胞球状，革兰氏反响阳性，菌片生生长，过氧化氢酶测定为阳性，氧化酶测定为阴性，代谢为发酵型。查伯杰氏手册为微球菌科葡萄球菌属。4 号菌：细胞杆状，形成芽孢，不多于一个。革兰氏反响阳性，代谢为发酵代谢，产生过氧化氢酶。查伯杰氏手册为芽孢杆菌科芽孢杆菌属。试验心得：1、 配方中使用的糖类不同，配置出的百里酚培育基的颜色不同。本试验使用了乳糖，培育基呈透亮的墨绿色。通过与其他小组的沟通，使用蔗糖配置出的兰色培育基观看效果较 好。2、 在细胞色素氧化酶测定试验中，用于培育试验材料的平板培育基由于在灭菌时，高压锅消灭问题，灭菌不彻底，培育基中长出了众多杂菌菌落。由此更深一步加强了无菌操作及彻底灭菌的意识，灭菌不彻底或感染将会导致一次试验的失败。3、 生疏了一般微生物试验的整个操作过程以及一般试验都包括哪些局部。4、 熬炼了独立思考，初步设计试验的力气。5、 试验前应对整个试验进展充分的设计及统筹，包括试验当中要用到的器材的种类、数量、药品，并预先进展必要处理，如：灭菌等，以保证明验的正常进展。6、 培育了团队协作精神。参考文献：伯杰氏手册