植物原生质体培养.docx

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1、第六章：植物原生质体培育请问同学们你知道哪些植物育种的方法？（杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍 体育种、基因工程育种、植物组织培育、植物体细胞杂交、动物细胞核移植等。）自1999年11月20日中国的神舟飞船首飞获得胜利后，2022年6月16日18时许 中国的载人航天飞船神舟九号放射胜利，6月29日10时许，神九载人飞船返回舱在 内蒙古主着陆场平安着陆，这次放射验证了空间交会对接技术，首次实现地面对在轨飞行 器进行人员和物资的来回运输与补给，我们国家的载人航天工程的空间试验室工程有 望实现。2002年12月30日凌晨神舟四号放射升天，一起带入太空的还有一批特殊 的乘客100粒牡丹花种子。有着

2、牡丹城之称的洛阳，将牡丹种子送上太空进行育 种，是洛阳城牡丹战略的一个重要组成部分。经过太空环境的各种重粒子、强辐射等 作用，相当一部分种子的性状会发生较大的变异，或许牡丹花开的会更大更艳丽。神舟四 号”共搭载了几百种的植物种子、组织胚胎试管苗、生物菌种等。此外，太空环境还是一个微重力环境。中科院（上海生命科学讨论院植物生理生态讨 论所和中科院上海生物化学细胞生物学讨论所）的科研人员，分别将细心培育了 10年的 不同品系的烟草细胞，小白鼠淋巴细胞和骨髓瘤细胞也带入太空，进行了太空细胞电融合 试验（由于重力沉降现象消逝，不同的细胞更简洁融合，提高融合率和细胞存活力），以期 获得新品种。这就是这则

3、新闻提到的动植物细胞进行的“太空婚礼。自然条件下，植物间遗传物质的交换可以通过有性生殖来实现，保持物种稳定性的同 时，也推动了物种的进化。但物种间存在的生殖隔离，制约了物种间的遗传信息的交换和 整合，也限制了通过杂交进行的作物遗传改良。因此，人们就想方设法，从其它的途径查 找突破口。细胞融合技术为克服这一障碍供应了一条新的途径。而植物细胞是有细胞壁包6.2.4 原生质体活力检测在原生质体培育前，常常先对原生质体的活性进行检测。测定原生质体活性有多种方 法，如观看胞质环流、活性染料染色、用荧光素双醋酸酯（FDA ）染色等。目测法：在显微镜下观看，依据细胞形态、流淌性确定原生质体活力。形态上完整、

4、 富含细胞质、颜色艳丽的正常球形原生质体为有活性的原生质体。假如将其由低渗溶液中 转入高渗溶液中，细胞会膨大恢复原状。FDA法：FDA （二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细 胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧 光显微镜下通过具荧光的细胞的观看确定细胞活性。而无活力的原生质体不能分解FDA , 因此无荧光产生。伊凡蓝染色法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严峻损坏使，细胞才能被染色， 因而可以通过细胞被染色与否确定活性。此外，还有酚藏红花染色法（无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色） 等。6.2.5 影响原生质

5、体活力的因素1）供试材料：生长旺盛、生命力强的组织。如：幼嫩叶片，无菌苗子叶和下胚轴，愈 伤组织或细胞悬浮物，花粉细胞（单倍体特殊材料2）酶解条件不同植物种类、组织和细胞由于细胞壁结构、组成不同，分解细胞壁所需酶的种类、 浓度、组合及酶解时间也不同。酶制剂活力和纯度：粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活 力是有害的。因此，在使用之前须将这些酶纯化，一般采用凝胶柱使酶制剂脱盐纯化。不 同的厂家生产的酶的活性有差异。如：上海植物生理讨论所从野生型绿色木霉中提取制成 的ZA3867纤维酶不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分别出植物原生质体。（德国 sigma纤维素酶的价格）酶解温

6、度（酶的最适温度为40 50,实际分别温度一般为25 30 I酶解时间 （一般而言，分别原生质体的培育时间与温度成反比，可是高温下短时间分别的原生质体 不适于培育，他们易发褐和裂开。实际酶处理时间一般不超过24小时。X酶溶液的pH（酶 溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培育材料时，发觉原始 pH值为5 . 0时，酶活力高，原生质体产生一得很快，但损坏较严峻，并且培育后大量裂 开。当pH值提高到6.0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5 . 0时处理同样时 间后相比，原生质体数量显著增加。原始pH值提高到7 . 0时酶活力差，生活的原生质体 数量进一步增加，损伤的原生

7、质体也少得多X3）渗透稳定剂的作用在分别原生质体时，渗透稳定剂有爱护原生质体结构及其活力的作用。由于不同材料 的生理特点不同，在讨论游离条件时，必需试验不同渗透压浓度的细胞，找出相宜的渗透 浓度。在原生质体讨论中，常用的两种渗透压稳定系统为：a.糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.400.80mol/l。 可使分别的原生质体能再生细胞壁，并能连续分裂。其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作 用。（多数状况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由于它的钝性及集中入原生质体的速 度很慢的原因，这样一来能保证一个稳定的渗透压。）b、盐溶液系统：包括KCI、MgSCU和KH2P。4等。其优

8、点是获得的原生质体不受生 理状态的影响，因而材料不必在严格的掌握条件下栽培；不受植株年龄的影响，使某些酶 有较大的活性使原生质体稳定。（简洁说，盐溶液系统使获得的原生质体更稳定，也更简洁 培育力近年来多采纳在盐溶液内进行原生质体分别，然后再用糖溶液作渗透稳剂的培育基中 培育。此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾（质膜稳定剂，硫酸葡聚糖是一种广 泛用于较长双链探针杂交的促进剂，另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG ）,它可提高 原生质体的稳定性，降低酶液中核酸酶的活力，并使离子稳定，爰护原生质膜，使细胞持 续分裂，对形成细胞团有促进作用。此外，添加牛血清蛋白（Bovine serum alb

9、umin, BSA）可削减或防止降解壁过程中对细胞器的破坏（血清蛋白形成了血清的粘度，可以爱护细胞 免受机械损伤，特殊是在悬浮培育搅拌时，粘度起到重要作用。在ELISA等试验中，常用 作封闭剂，作为中性蛋白填充空置位置，防止非特异性背景标记。还有氯化钙等）4）光照由于脱壁的原生质体对光特别敏感（植物细胞大多含有光敏色素，汲取红光，调整细 胞的生长发育，导致原生质体膨大，易裂开），分别原生质体的过程一般是在黑暗条件下进 行的。此外，分别的条件，如离心次数、离心速度、分别持续的时间、分别用具等也会影响 原生质体的活力。所以操作中肯定要留意这些问题。6.3原生质体培育原生质体培育的概念：指将植物细胞

10、游离成原生质体，在相宜的培育条件下，依据细 胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。原生质体 培育只是原生质体讨论的一个方面再生植株。6.3.1 培育原生质体的方法1）液体浅层培育液体培育法是在培育基中不加凝胶剂，原生质体悬浮在液体培育基中静止培育的方法, 常用的是液体浅层培育法，即含有原生质体的培育液在培育皿底部铺一薄层，封口后进行 培育。优点：原生质体在液体环境中表现出较强的细胞分裂力量。操作简洁，对原生质体的 损伤小，且易于添加新奇培育基和转移培育物。缺点：原生质体分布不匀称，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生 长和发育。此外，难以跟踪观看某一

11、个细胞的发育状况。2）双层培育又分为液体-固体双层培育和固体-固体双层培育法。在培育皿的底部铺一层琼脂（琼 脂糖），再将原生质体悬浮液或等体积的琼脂与原生质体悬浮液混合液涂布在固体培育基表 面。优点：固体培育基中的养分物质可以缓慢释放到液体或上层培育基中，假如在下层固 体培育基中添加肯定量的活性炭，还可以吸附培育物产生的一些有害物质，促进原生质体 的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观看细胞的发育过程。3）固体菌层培育该法是将悬浮在液体中的原生质体悬液与热融的含琼脂的培育基等量混合，冷却后原 生质体包埋在琼脂培育基中，封口后进行培育。其不同之处在于，原生质体接种的细胞多, 植物细胞培育接种的细胞少

12、。优点：使原生质体处于固定位置，避开了原生质体的漂移游动，有利于对单个原生质 体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观看。缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度把握必需合适，温度偏高影响原生质体活 力，温度偏低琼脂凝固太快，不利于原生质体混合匀称。止矽卜，固体中单细胞生活力量弱, 通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。由于琼脂熔点较高，因此在固定培育中保持琼脂培育基较高的温度和相对猛烈的摇动 是使原生质体在培育基中分布匀称的前提，这样就简洁对原生质体造成损害。此外，琼脂 对原生质体是有毒害的，只能是一些生命力较强的植物原生质体才可以用这种方法来培育。为此，人们不断寻求低毒并可在常

13、温下凝固的物质来代替琼脂。近年来很多试验证明，琼脂糖是一个良好的培育基凝胶剂，它不仅具有熔点低的特点 而且具有促进原生质体再生细胞分裂的作用。对琼脂糖、琼脂及经过漂洗的纯洁的琼脂的 比较试验，发觉尽管纯洁的琼脂可以提高一些原生质体的植板率，但最好的结果是在琼脂 糖上取得的，并且琼脂糖适用于广泛的植物种。他们发觉在琼脂中不能分裂的天仙子属的 一种在琼脂糖中能持续分裂并且比在液体培育基中形成细胞团的频率高。在琼脂糖培育基 中，烟草原生质体发育到细胞团所需的接种密度要比在琼脂或液体培育基中的低。在水稻 原生质体培育也证明，提高琼脂糖的浓度可以明显地提高原生质体的引起的出芽现象，从 而提高了培育初期的

14、原生质体的成活率。由于上述缘由，琼脂糖作为一种优良的凝胶剂，在原生质体培育中的应用越来越广泛。4）琼脂糖珠培育类似于植物细胞培育，我们还可以进行琼脂糖珠培育。将含有原生质体的液态琼脂糖 培育基用吸管以大约50|jl 一滴的量滴于直径6cm的培育皿，待其固化后向其中添加3ml 液体培育基并于摇床上低速旋转培育。培育过程中，通过调整液体培育基的渗透压来调整培育物的渗透压以利于其进一步的 生长和发育。这种方法由于改善了培育物的通气和养分环境，从而促进了原生质体的分裂 和细胞团的形成。其它用于细胞培育的一些技术，如悬滴培育、微室培育、看护培育等技术，也已在原 生质体培育中得到应用。6.3.2 、愈伤组

15、织形成和植株再生原生质体再生过程是指分别、纯化的原生质体在适当的培育方法和良好的培育条件下, 很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最终或通过愈伤组织或通过胚状体分化 出完整植株的过程。1）细胞壁再生依据前面介绍的方法培育原生质体。原生质体培育数小时后开头再生新的细胞壁，一 至数天内便可形成完整的细胞壁。新合成的细胞壁可以用0.1%荧光增白剂（Calc。 fluor-white, CFW ）染色后在荧光显微镜下观看，可见到绿色荧光围绕细胞表面，证明细 胞壁已经形成（CFW专一性地与细胞壁纤维素的B-葡萄糖苗键特异性地结合X也可用高 渗溶液产生质壁分别的方法、电子显微镜观看技术和冰冻蚀刻法

16、等进行再生细胞壁的讨论。 电镜辨别率较高，可观看到纳米级的结构（透射电镜（辨别率达0.2纳米）一细胞内部结 构；扫描电镜（辨别率5-7纳米）-组织、细胞和器官表面和立体结构；最小的细胞是支 原体，直径100nm X电镜观看发觉，原生质体培育数小时后新壁开头形成，先是质膜合成形成细胞壁主要 成分的微纤维，然后转移到质膜表面进行聚合作用产生多片层的结构，以后在质膜与片层 结构之间或在膜上产生小纤维丝，渐渐形成不定向的纤维团，最终形成完整的细胞壁。再生细胞壁主要成分为非纤维素多糖，其葡萄糖占65%，纤维素只占5% （烟草叶肉 细胞细胞壁纤维素含量占60% 细胞壁的形成与细胞分裂有直接关系，凡是不能再

17、生细胞壁的原生质体也就不能进行正常的有丝分裂。细胞壁的再生标志着原生质体培育胜利。2)细胞分裂和生长一般原生质体培育2 7d后开头第一次分裂，但开头第一次分裂的时间随植物的种类、 分别原生质体的材料、原生质体的质量、培育基的成分和培育条件而异。用幼苗的下胚轴和子叶、幼根、悬浮培育的细胞、未成熟种子的子叶等为材料分别的 原生质体，一般比用叶肉分别的原生质体简洁诱导分裂，第一次分裂消失的时间较快。(Figure 1) Asymmetric cell division of a Physcomitrella protoplast. Regular asymmetric cell division (

18、1, 2) and defective cell division with overexpression (3, 4). Cell wall of the cell in (1) is visualized with calcoflor in (2).细胞分裂时，在两组染色体之间，也就是在母细胞的赤道板面上，有很多大小不一的 分泌囊泡(secretory vesicles)不规章地汇聚在一块，这些小囊泡是由高尔基体和内质网分 泌而形成的，其中富含组成细胞壁的各种糖类，它们借助与细胞赤道板垂直方向上存在的 微管的运动，渐渐整齐地排列成片，组成成膜体(phragmoplast)。成膜体中的囊泡膜

19、相互 融合与连接形成细胞的质膜，其中的内含物连成一体构成细胞板，这是雏形的中层结构。 细胞板组成后，高尔基体小泡运输造壁物质释放到质膜外，以充实新形成的壁。当细胞板 中渐渐有果胶质和少量纤维素分子不断地填充和掺入时便构成了中胶层，在中层两侧间续 有纤维素和半纤维素等物质的沉积则形成了质地松软的初生壁，这时两个子细胞便形成。此后高尔基体小泡将构成细胞壁的糖蛋白的前体物质运输和分泌到细胞壁中，与纤维 素、半纤维素及果胶相交联，形成高度复合体的网状结构。同时，其它蛋白和各种酶通过高尔基小泡和内质网小泡运输和分泌加入细胞壁，形成完整的初生细胞壁。3）愈伤组织形成大多数状况下原生质体培育二周后，形成多细

20、胞的细胞团，三周后形成肉眼可见的小 细胞克隆。大约六周后形成直径1mm的小愈伤组织。原生质体培育710天后必需准时添加新奇培育基，否则形成的细胞团不连续生长。 待小愈伤组织长至1mm左右时应准时转移到固定培育基上使其进一步生长。4）植株再生原生质体形成的愈伤组织直接转移到分化培育基上可一步成苗。然而，越来越多的试 验证明，两步法成苗更适合大多数植物原生质体再生植株。即：首先将愈伤组织培育于含 低浓度生长素培育基上，让其增殖和调整状态，再将其转移到分化培育基上分化成苗。回顾原生质体的再生过程：原生质体在合适的培育基和相宜的培育条件下，经24d 可再生细胞壁，并很快进入细胞分裂状态，约约12个月后

21、，通过细胞的持续分裂，在 培育基上消失肉眼可见的细胞团。细胞团长到2 4mm左右，即可转移到分化培育基上, 诱导芽和根长成完整的植株。6.3.3 影响原生质体培育的因素1）基因型较早的试验曾证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所掌握的。通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分别的遗传分析，证明其愈伤组织的再生力量 是2个显性基因所打算的(Koornneef M et al.,1987)o Cheng和VeilleuxQ991)对马铃薯 野生二倍体种(S.Phureja)原生质体的培育力量也做过遗传分析，并证明从原生质体培育到 形成愈伤组织是受2个独立位点的显性基因所掌握(Cheng

22、 et al, 1991)。Dudits等(1991)用苜宿(Medicago sativa)不同基因型做了较深化的讨论，认为有 某个基因型在离体培育时难以形成细胞胚。但是，假如将对激素调整有作用的发根农杆菌 的rolB和rolC基因引入并表达，就可能促使其体细胞胚形成。2)原生质体的来源供体材料体类型：叶肉细胞、愈伤组织或悬浮细胞生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体 的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。用于原生质体分别的植物外植体有叶片、叶 柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培育物(Suspension cultures 原球 茎、花瓣和叶

23、表皮等。叶肉细胞是常用的材料，由于叶片很易获得而且能充分供应。取材 时，一般用刚绽开的幼嫩叶片。另一个分别原生质体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞， 采纳其作材料可以避开植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于掌握新生细胞的年 龄，处理时操作便利，无需消毒.供体细胞的分化程度：同原生质体分别相同，原生质体的活力和再生力量与外植体的 来源，或者说供试材料的生理状态亲密相关。子叶及下胚轴获得的原生质体培育对培育壮 苗至关重要。裹的，实现细胞融合，首先要突破细胞壁的障碍。6.1 原生质体的概念和讨论进展6.1.1 原生质体的概念原生质体(protoplast):我们把除去细胞壁、暴露的、有生活力的原

24、生质团或是说一 个被质膜所包围的暴露细胞，称为原生质体。它是能存活的植物细胞的最小单位。与原生质体相关的一些概念，如(课本P128 ):亚原生质体Gubprotoplast):在原生质体分别过程中，有时会引起细胞内含物的断 裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。核质体(nudearplast):由原生质膜和薄层细胞质(少量细胞质)包围细胞核形 成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。胞质体(cytoplast):不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。核质体和胞质体一个是缺少了细胞核，一个是缺少了部分的细胞质。假如用脱核技术, 细

25、胞经松胞菌素B(Cyto chala sin B ; CB)处理、并离心(以10mg/L的浓度浸没，以 12000r/min离心1520分钟)，细胞核可从细胞中分别出来，可使99%的细胞发生脱核, 形成无核细胞质体(Cytoplast)和无胞质的核质体(Nucleoplast),可用于做多种讨论。6.1.2 原生质体讨论进展供体细胞的生长同步性：悬浮细胞在生长过程中，也不是全部的细胞都适合原生质体 的培育。尤其是多次继代的细胞简洁消失染色体结构和数量变异。我们可以通过过滤，筛 选形态大小较全都的悬浮细胞，除去老细胞，便于对原生质体培育的掌握。3）起始培育密度基本起始密度：原生质体培育基中原生质

26、体的密度对分裂的影响很大，培育的相宜密 度在104105个/ml左右。在烟草叶原生质体培育中,密度低于103个/ml时，细胞只能 分裂一、二次，且能持续进行下去，密度在IO,个/ml以上，植板率常显著提高。低密度 条件原生质体不能生长的缘由，可能在于细胞代谢产物集中到培育基中去，而影响细胞内 的浓度。如在培育基中添加若干代谢中间产物，低密度的原生质体生长发育也能正常进行。4 ）培育基和细胞培育相比，原生质体只是缺少了细胞壁，因此原生质体培育基一般是加以转变 的细胞培育基。（如原生质体培育常常使用的KM-P培育基就是以B5培育基为基础；NT 培育基则以MS培育基为基础。）但原生质体无论在结构上和

27、代谢生理上和细胞究竟是有很 大差异，在培育原生质体时，单纯地仿照细胞培育基往往不能达到满足的培育效果，需要 考虑到原生质体的独特要求。a、培育基激素水平：激素对原生质体的生长发育是特别重要的。但由于不同的植物种 对激素的种类和浓度有很不同的要求，对牛豆树原生质体培育认为2,4-D对细胞分裂是必 不行少的，并且不能用NAA和IAA来代替，这种在细胞内合成的激素和其他细胞内物质 向外释放时，外渗的速度和力量也不相同。内源激素外渗后，提高了培育基中激素的浓度 使得不同植物原生质体对外源激素的种类和浓度的需求产生了很大差异。由于细胞在培育过程中能够合成一些物质并外渗到培育基中，采用这个特点来制成条 件

28、培育基，即对某种材料的细胞培育肯定时间后，培育基中已含有这种材料外渗的激素、 氨基酸等物质，再把这种材料的细胞去掉。用这种条件培育基足以促进其他材料的细胞生 长。用培育了 3天的长春花细胞的悬浮培育液作条件培育基，加到长春花原生质体培育 基中，极大地促进了长春花原生质体的生长和分裂。用条件培育基作烟草原生质体低密度 培育也提高了培育效果。尽管原生质体培育对激素的种类和浓度的要求有很大差异，但总的来说，生长素和细 胞分裂素是需要的，并需要二者的适当搭配。同时，在不同的发育阶段需要不断地对激素 的种类和浓度进行准时的调整。此外，在每一步调整激素时，还须考虑到它的后效应。如 牛豆树原生质体培育中，再

29、生细胞的起始分裂需要有2,4-D存在，但它对以后的器官分化 却有抑制作用。而实际上，器官分化的打算因素在愈伤组织形成的初期就发生了，假如只 为了愈伤组织的发育而连续保留较高浓度的2,4-D ,就有可能抑制器官发生而使原生质体 培育不能获得再生植株。无机盐以离子状态存在于培育基中，易于被植物细胞汲取和采用，无机盐是培育基的 主要构成成分，依据其含量，可分为大量元素和微量元素两部分。在大量元素中，对原生质体培育效果影响最大的是Ca2+和NH4+。较高的Ca2+浓 度能提高原生质体的稳定性，这是由于Ca2+能保持原生质体质膜的电荷平衡。因此很多 游离原生质体的酶液中都添加肯定量的Ca2+和其他阳离子

30、。在培育中，较高浓度的Ca2+ 对原生质体的生长发育同样有利。如高浓度的钙促进了豌豆原生质体的存活和细胞分裂。 因此，在很多植物的原生体培育中，应用大量元素减半的MS培育基时，但Ca2+的浓度未降低，保持MS培育基中所用的浓度。虽然氮源是植物细胞不行缺少的养分，但已发觉高浓度的NH4+可抑制马铃薯原生质 体的生长发育。在有关菊苣叶肉原生质体培育时，把MS培育基中的氨和硝酸盐全部去掉, 只用谷氨酰胺作为氮源，得到了好的结果。把水稻原生质在B5培育基上培育810天后, 转移到完全去除无机氮素，而用4种氨基酸作为氮源的AA培育基上，获得了来源于原生 质体的水稻再生植株。无机养分中铁、钙、镀等的浓度对

31、原生质体培育有重要影响。铁盐大多采纳MS培育 基中的铁盐浓度。但当把MS培育基中的铁盐浓度降低10倍时，则可以大大增加原生质 体存活和分裂的数量；适当提高培育基中钙浓度，降低镀盐浓度，有利于原生质体的存活, 细胞再生和连续分裂。豌豆在高钙中3天后已有10%原生质体或再生细胞分裂，而在低钙 中则只有3%。马铃薯原生质体只在10mg/L的钱盐中仅23天内就死亡。c、有机成分原生质体的生长发育需要维生素类及各种有机成分，在培育蚕豆属的一个种的原生质 体时，为了适应低密度的培育，人们设计了 KM-P培育基，它包括丰富的维生素、氨基酸、 有机酸、核甘酸、糖及糖醇等有机成份。后来这个培育基在原生质体培育中

32、得到广泛应用。 讨论表明：多胺类物质对原生质体发育有肯定的促进作用。有些报道认为：在培育基中添 加一些自然有机物质对原生质体的生长有利，如酵母提取物、椰乳等。d、渗透压稳定剂由于去除了细胞壁，原生质体培育基中须有肯定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定。常用的是甘露醇、山梨醇、蔗糖及葡萄糖等糖类。由于这类物质既保持培育基的 渗透浓度，又是原生质生长发育的碳源，因此其种类和浓度会影响培育效果。对原生质体 培育来讲，蔗糖不如葡萄糖。用葡萄糖代替甘露醇，可提高原生质体的植板率。近年来很 多试验证明葡萄糖是原生体培育中比较抱负的渗透压稳定剂和碳源。不同的糖类，只对培育效果发生影响，在游离时，并无显著

33、影响。说明在原生质体发 育时，对碳源有肯定的要求。随着细胞壁的再生和细胞的持续分裂，渗透剂的浓度须不断 降低，才对培育物的生长有利。用添加鲜培育基的方法进行杨树原生质体培育，每周使渗 透剂的浓度降低O.lmol/I ,导致了培育物的持续生长，发育成愈伤组织并分化成再生植株。e、pH 值原生质体培育基的pH值一般为5.65.8。pH值除了直接影响原生质体及再生细胞的 生理活动外，还能影响外源生长素是否对培育物产生毒害。当pH6.4时，2,4-D的浓度即 使到达30mg/l ,细胞也还能持续分裂。还有人认为原生质体游离时的pH值对培育效果也 有影响。在酶液的pH为5.5时，豆工豆原生质体的产量最高

34、，但pH为6.0时产生的原生 质体才具有持续的细胞分裂力量。以烟草无菌苗为例说明原生质体的分别过程。首先将植物材料在相宜的条件下进行培育。A.取生长3周的烟草无菌苗平展嫩叶，置于含有一薄层600mmol/L甘露醇-CPW溶液中，在4黑暗下预处理6-8小时;悬浮细胞置于4黑暗下预处理48小时（光照有利于细 胞分化IB.预处理的叶片用吸管吸去预处理液，悬浮细胞离心转入培育皿中，然后加入2%纤 维素酶、0.4%果胶酶溶液，用封口膜将培育皿封严，置于暗处在2426V下保温酶解；C.在倒置显微镜下观看，细胞壁已降解，有圆球形原生质体释放到溶液中，即终止酶 解（一般酶解1224h X用吸管轻轻压挤，以释放

35、出全部原生质体；D.通过一个6080pm的细胞筛过滤以除去较大的碎屑。滤液置于1个螺帽离心管 中，在100g下离心3min ,使原生质体沉降；E.将沉降物缓慢加入含有860mmol/L蔗糖配制的CPW溶液:细胞-原生质体清洗液） 的螺帽离心管中，在100g下离心lOmin ;F.将蔗糖溶液的上部原生质体带收集起来，并转入到另一个离心管中。在离心管中加 入原生质体培育基以使原生质体悬浮，在100g下离心3min ,重复本相清洗过程至少3 次；G.最终一次清洗之后，加入培育基调整原生质体密度至0.5x105到ixl05/m|。1）熟悉阶段：自从迪雅尔丹（F.Dujardin,1835）在低等动物根

36、足虫和多孔虫（原生动 物）的细胞内.发觉了内含物（特别匀称、有弹性、能收缩的胶状物质）,称之为“肉样质 （sarcode）。其后1840年普金耶（Pukinje ）在动物，1846年冯莫尔（Von Mohl ）在植 物细胞中也看到了 肉样质”的东西，并命名为原生质。1861年舒尔策（Max Schultze ） 认为动物细胞内的肉样质和植物细胞内的原生质具有同样的意义。由此提出了原 生质理论：有机体的组织单位是一小团原生质，这种物质在一般有机体中是相像的。至此, 细胞的含义就和最初发觉时大不相同了。于是汉森（Hanstein , 1880 ）就提出原生质体 （protoplast）,精确的说动

37、物细胞就是一个原生质体。但由于cell （原意小室）一词沿用已久，因此人们仍采纳了旧名。2 ）原生质体分别讨论阶段（机械法）:1892年Klercker （克莱克）首先用机械法分 别得到原生质体，将叶肉细胞、愈伤组织和液体悬浮培育细胞置于高渗的糖溶液中，使之 质壁分别，原生质体收缩成球形。这时用剪刀剪碎组织，就有可能切开细胞壁后获得少量 完整的原生质体。但数量少且易受损伤。3 ）原生质体分别讨论阶段（酶法）：1960年，英国植物生理学家Cocking （科金）首先用酶解法从蕃茄幼苗的根分别原生质体胜利。他使用一种由疣抱漆斑菌培育物制备的 高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。直至1960年后纤维素酶

38、和离析酶成为商品酶投入市场，植物原生质体讨论才成为一 个热门的领域。4 ）原生质体再生植株讨论阶段：1971年，Takebe （日,塔克伯）et al.首次得到烟草叶肉原生质体培育的再生植株。据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培育得到了再生植株 (1993 其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等 植物向低等植物扩展。原生质体讨论的意义(略，课本P94 )1)单细胞无性系的建立经过原生质体培育，可产生单细胞无性系(cell cloning )，以及再生植株(regenerative ability)o而单细胞无性系为在细胞水平上进行的突变

39、体的筛选、次生代谢物生产、人工种 子生产、种质资源库的建立等供应了特别抱负的受体系统。植株再生的讨论的一个方面是细胞分化，在讨论分化问题时，用一个均一的原生质体 群体可以筛选数以千计的不同物理、养分和激素条件，来探究诱导单细胞的分化条件等。2)遗传转化的良好受体原生质体无细胞壁，易于摄取外源遗传物质、细胞器等，在遗传学方面进行基因互补, 连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的讨论等，为植物基因工程讨论供应了抱 负的遗传试验操作体系。3)体细胞杂种的形成用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法。由于细胞壁被 溶解，有利于细胞间相互融合，克服了常规育种中远缘杂交的生殖隔离

40、障碍，有利于培育 新的品种。4）多种基础讨论的试验体系采用原生质体可以进行很多基础理论讨论，如讨论细胞生理（因无细胞壁，试剂对细 胞作用更为直接，其反应能直接测量，以便反应产物能较快的分别出来），细胞的分化和发 育，讨论细胞质膜的结构和功能，细胞壁再生的、病毒侵染机理等方面的讨论。此外，从 原生质体中可提取细胞器或DNA ,用于进一步的讨论。6.2原生质体的制备要分别植物原生质体，必需去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞 壁，在本世纪前期是采纳机械法分别。这种方法分别的原生质体太少，且只能适于部分组 织，Cocking （ 1960年）创造的酶解法，开创了大量分别原生质体的新技术

41、，现在被普遍 应用。我们以酶处理方法为例，介绍原生质体的分别。6.2.1 植物材料一般来说根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分别原生质 体的材料。但要选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。植物的其它器官也可用于分别原 生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。常选用的材料是悬浮培育细胞和叶肉细胞：1）细胞悬浮培育物在建立细胞悬浮培育物之前，需提前培育愈伤组织。即取用成熟种子胚、未成熟胚、 幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26（黑暗条件（有利于细胞脱分化）下, 在含2,4 - D （诱导愈伤组织或体细胞胚作用显著）2 4mg/L的MS固体培育基上（应 用最为广泛），诱导愈

42、伤组织，每隔2 4d转接一次（愈伤组织的继代培育，一代为20 do 假如延长培育时间，培育基中的养分物质会削减，外植体也会分泌一些有毒物质，造成自 身中毒。X从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培育一次后，转移到液体培育 基的100ml三角瓶中进行悬浮培育。详细方法是用旋转式振荡器,速度掌握在80 120r/min ,在251下暗培育。悬浮培育初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取45ml悬浮细胞转到250ml三角 瓶的40ml新奇培育中,以后每隔7d继代一次（每个7d一次的继代周期中,拟南芥悬浮细 胞的生长表现明显的S型生长曲线，正常培育条件下,继代后24 d消失快速生长，此后

43、生长 量快速下降,但接种量不同，其继代后悬浮细胞生物量及快速增长发生时期不同.维持7 d继 代周期的抱负接种量为起始悬浮液按10 mL/50 mL稀释.接种量小，生长迟缓，甚至不能增 殖）o通常经悬浮培育34月后，悬浮培育细胞的大小变得较为全都，且细胞质变得较浓 时，可用作分别原生质体。2）叶肉细胞叶肉细胞是分别原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，要考 虑植株的生长环境，用黑暗处理、低温处理和不同光质照耀等方法，可提高某些材料原生 质体的产量和活力（考虑环境的光线、温度、湿度等光强为30006000Lx ;温度为 20 25C培育;相对湿度在60 80%左右），叶片的年龄及

44、其生理状态对原生质体分别 的影响。取生理状态相宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。采用无菌苗可免去表面灭菌的操作步骤避开因条件不适而产生的材料生长的不良影 响。原生质体的分别机械法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生稍微质壁分别，原生质体收 缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。缺点：获得完整的原生质体的数量较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限 制。优点：可避开酶制剂对原生质体的破坏作用。酶法：将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温肯定时间，在酶液的作用下， 细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。该过程可分为两个阶段：酶处理、

45、 原生质体的收集和纯化。优点：获得量大，适用广泛。缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，会影响所获原 生质体的活力。酶处理（A-C）分别原生质体最常用的酶有纤维素酶（从绿色木霉等提取的一种复合酶制剂，具有降 解纤维素作用）和果胶酶（从根霉中提取出来，使细胞间的果胶质降解XA.取生长3周的烟草无菌苗平展嫩叶，置于含有一薄层600mmol/L甘露醇-CPW溶液 中（渗透压稳定剂，提高原生质体的分裂频率，适应培育基的高渗环境等作用），在4（黑 暗（低温柔黑暗条件下，削减代谢活动）下预处理6-8小时;悬浮细胞置于4黑暗下预处 理48小时（光照有利于细胞分化XB.预处理的叶片用吸

46、管吸去预处理液，转入培育皿中，然后加入2%纤维素酶、0.4% 果胶酶溶液（植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片 需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液1030ml不等。），用封口膜将培 育皿封严，置于暗处在2426下保温酶解;C.在倒置显微镜下观看，细胞壁已降解，有圆球形原生质体释放到溶液中，即终止酶 解（一般酶解1224h 用吸管轻轻压挤，以释放出全部原生质体；酶解时间、温度和酶的浓度影响着原生质体的活力。原生质体的收集和纯化（D-G ）在分别的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，裂开的原 生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会

47、对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶 溶液。以净化原生质体，清除这些杂质的过程称为原生质体纯化。（植物单细胞分别后过滤, 经洗液悬浮，再离心收集；原生质体收集也要先过滤，然后离心，但其要求的纯度更高， 离心时在溶液中加入渗透压稳定剂X目前原生质体纯化方法有三种，即沉降法、漂移法和不连续梯度法。沉降法：是在比重小、具有肯定渗透压的溶液中，先对酶液处理好的混合物进行过滤, 然后低速离心，使纯洁完整的原生质体沉降于试管底部的纯化方法。常用甘露醇（小分子量）作渗透压调整剂，再用Percoll漂移一次。对离心力无严格要求，操作比较简洁，但在游离和清洗过程中易损伤原生质体（原生 质体沉积于试管底部，造

48、成相互挤压X漂移法：是采纳比原生质体密度大的高渗溶液，使原生质体漂移在液体表层的纯化方 法。常用的漂移剂有蔗糖、Percoll （珀可，一种包有乙烯叱咯烷酮的硅胶颗粒，其混悬 液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分别 纯化X Ficoll （聚蔗糖X fructosan （聚果糖避开原生质体振荡或被离心力挤压而损坏，所用药品简洁，成本低旦对离心力要求 严格，把握不好，原生质体不易漂移。可采纳不同浓度和不同离心速度分次漂移的方法。不连续梯度法：采纳两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破 损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。如：Hughes（1978）采纳450mmol/L蔗糖（底部）和450mmol/L甘露醇（顶部）不连 续梯度来纯化原生质体。想一想：离心的结果，原生质体层在溶液的什么位置？（蔗糖层在下层，甘露醇在上 层，原生质体在蔗糖层和甘露醇层之间X可以收集到数量较大的纯洁原生质体，同时避开收集过程中原生质体相互挤压而裂开。