3D细胞培养_医学心理学-基础医学.pdf

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1、3D多细胞肿瘤球的培养 原创 2017-04-20 医生科研助手 3D多细胞肿瘤球是在体外应用组织培养方法使肿瘤细胞以多细胞集聚体的形式生长成为具有三维结构的球体。与传统的 2D贴壁细胞培养模型相比，3D多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征。因此，3D多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用于干细胞培养和分化、癌症研究、药物和毒性筛选及组织工程等特定应用中。虽然 3D多细胞肿瘤球模型具有更显著的实体肿瘤生理相关性，但是与 2D贴壁细胞培养模型相比，获得大量相对统一的 3D多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表征手段。本文

2、利用 Liquid Overlay 的制备方法，以乳腺癌细胞 MDA-MB-231 和 MCF-7 为模型制备 3D多细胞肿瘤球并采用倒置显微镜、激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜对其进行详细表征。1 实验前准备工作 1.提前 24 h 取 12 mL DMEM 和 RPMI 1640 完全培养基（含 10%FBS，下同）于 50 mL离心管内，置于 4冰箱中预冷；2.将分装好的 Matrigel基质胶提前 24 h 从-20放入 4，使其融化成液体状态；3.将无菌的 1 mL 移液器枪头放入无菌 50 mL 离心管内，置-20冰箱预冷。欢迎下载 2 2 琼脂糖包被 96 孔板 1.准确量取 6

3、mL RPMI 1640 培养基（或 DMEM 培养基）于 2 个 10 mL 的注射玻璃瓶内，加入90 mg 琼脂糖，盖塞后放入80的水浴锅内加热溶解30 min；2.加热结束后，将注射瓶放入灭菌锅内，115灭菌30 min；3.灭菌完成后，迅速取出注射瓶放入超净台内。将注射瓶内的琼脂糖溶液倒入无菌的加样槽中，用多通道移液器以每孔60 L 的量加入 96 孔板内。注意：由于琼脂糖溶液在室温时会凝固，因此从灭菌锅内取出琼脂糖溶液后一定要快速转移至超净台内并迅速加入至96 孔板中。此外，为保证加样时琼脂糖不冷却，需要同时灭菌加样槽和 100 L 的移液器枪头。4.加入完成后，96 孔板要保持水平

4、约 30 min 使孔内的琼脂糖凝固。3 配置含 Matrigel基质胶细胞悬液 1.取对数生长期的 MDA-MB-231细胞（或 MCF-7 细胞），胰蛋白酶消化后进行细胞计数，用 RPMI 1640完全培养基（或 DMEM 完全培养基）将细胞悬液浓度调整至 2.0105 cells/mL，备用。式生长成为具有三维结构的球体与传统的贴壁细胞培养模型相比多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络细胞与基质细胞与细胞之间的相互作用从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征因此多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用肿瘤生理相关性但是与贴壁细胞培养模型相比获得大量相对统一的多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表

5、征手段本文利用的制备方法以乳腺癌细胞和为模型制备多细胞肿瘤球采用倒置显微镜激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜从放入使其融化成液体状态将无菌的移液器枪头放入无菌离心管内置冰箱预冷琼脂糖包被孔板准确量取培养基或培养基于个的注射玻璃瓶内加入琼脂糖盖塞后放入的水浴锅内加热溶解加热结束后将注射瓶放入灭菌锅内灭菌灭菌完成 欢迎下载 3 2.将盛满碎冰的烧杯喷完酒精后放入超净台内，将 RPMI 1640完全培养基以及解冻的 Matrigel基质胶从冰箱内取出置于冰上。注意：由于 Matrigel基质胶在室温下溶液凝固，因此在操作过程中一定要保持低温。3.将预冷的移液器枪头取出放置于超净台内。根据计算量（2.5%

6、，v/v）用移液器将 300 L Matrigel基质胶加入到 12 mL RPMI 1640完全培养基内，迅速混匀。注意：由于 Matrigel基质胶在室温下溶液凝固，因此使用的移液器枪头也需要预冷。4.加入步骤 1 中的细胞悬液（约 600 L），使细胞浓度为10000 cells/mL，迅速混匀，备用；4 将细胞悬液铺入琼脂糖包被的 96 孔板 1.将上述步骤 4 中配置好的含有 Matrigel基质胶的细胞悬液放入加样槽内，用多通道移液器吸取 200 L 加入到包被琼脂糖的 96 孔板内。2.采用低温离心机进行离心，离心条件为4，1000g，10 min。注意：离心 96 孔板时为保持

7、无菌，将 96 孔板的周围用封口膜封住。式生长成为具有三维结构的球体与传统的贴壁细胞培养模型相比多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络细胞与基质细胞与细胞之间的相互作用从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征因此多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用肿瘤生理相关性但是与贴壁细胞培养模型相比获得大量相对统一的多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表征手段本文利用的制备方法以乳腺癌细胞和为模型制备多细胞肿瘤球采用倒置显微镜激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜从放入使其融化成液体状态将无菌的移液器枪头放入无菌离心管内置冰箱预冷琼脂糖包被孔板准确量取培养基或培养基于个的注射玻璃瓶内加入琼脂糖盖塞后放入的水浴锅内加热

8、溶解加热结束后将注射瓶放入灭菌锅内灭菌灭菌完成 欢迎下载 4 3.离心完成后，取出 96 孔板，摘下封口膜，喷洒酒精后放入培养箱内培养。整个培养流程如图 1 所示。4.在培养的第 3、5 和 7 天，更换孔内的 100 L 培养基并采用倒置显微镜观察肿瘤球的形态。5.若要采用 3D多细胞肿瘤球进行药物试验，在培养 7 天后，用移液器取出孔内的 100 L 培养基，加入 100 L 给药溶液，然后置于培养箱内培养并定期采用倒置显微镜观察肿瘤球的生长状况（图 2）。5 3D多细胞肿瘤球的表征 式生长成为具有三维结构的球体与传统的贴壁细胞培养模型相比多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络细胞与基质细胞

9、与细胞之间的相互作用从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征因此多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用肿瘤生理相关性但是与贴壁细胞培养模型相比获得大量相对统一的多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表征手段本文利用的制备方法以乳腺癌细胞和为模型制备多细胞肿瘤球采用倒置显微镜激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜从放入使其融化成液体状态将无菌的移液器枪头放入无菌离心管内置冰箱预冷琼脂糖包被孔板准确量取培养基或培养基于个的注射玻璃瓶内加入琼脂糖盖塞后放入的水浴锅内加热溶解加热结束后将注射瓶放入灭菌锅内灭菌灭菌完成 欢迎下载 5 1.倒置显微镜观察 3D多细胞肿瘤球形态：直接将 96 孔板置于倒置显微镜下观察即可

10、。2.激光共聚焦显微镜观察：用移液器小心取出孔内的肿瘤球，用 PBS清洗 3 遍后，采用 4%多聚甲醛固定，并用 Hoechst 33258 对细胞核进行染色，PBS清洗 3遍后在激光共聚焦显微镜下观察（图 3）。3.环境扫描电镜观察：用移液器小心取出孔内的肿瘤球，用 PBS清洗 3 遍后，固定干燥后进行环境扫描电镜观察（图 4）。式生长成为具有三维结构的球体与传统的贴壁细胞培养模型相比多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络细胞与基质细胞与细胞之间的相互作用从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征因此多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用肿瘤生理相关性但是与贴壁细胞培养模型相比获得大量相对统一的多细胞

11、肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表征手段本文利用的制备方法以乳腺癌细胞和为模型制备多细胞肿瘤球采用倒置显微镜激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜从放入使其融化成液体状态将无菌的移液器枪头放入无菌离心管内置冰箱预冷琼脂糖包被孔板准确量取培养基或培养基于个的注射玻璃瓶内加入琼脂糖盖塞后放入的水浴锅内加热溶解加热结束后将注射瓶放入灭菌锅内灭菌灭菌完成 欢迎下载 6 图 4 式生长成为具有三维结构的球体与传统的贴壁细胞培养模型相比多细胞肿瘤球可以通过模拟三维细胞网络细胞与基质细胞与细胞之间的相互作用从而更加贴近肿瘤组织中相应的病理生理特征因此多细胞肿瘤球培养模型已经逐渐应用肿瘤生理相关性但是与贴壁细胞培养模型相比获得大量相对统一的多细胞肿瘤球模型需要一系列的培养过程和表征手段本文利用的制备方法以乳腺癌细胞和为模型制备多细胞肿瘤球采用倒置显微镜激光共聚焦显微镜和环境扫描电镜从放入使其融化成液体状态将无菌的移液器枪头放入无菌离心管内置冰箱预冷琼脂糖包被孔板准确量取培养基或培养基于个的注射玻璃瓶内加入琼脂糖盖塞后放入的水浴锅内加热溶解加热结束后将注射瓶放入灭菌锅内灭菌灭菌完成