第二十一章 常用分子生物学技术原理及应用 齐医精品课程1_高等教育-生物学.pdf
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1、第二十一章 常用分子生物学技术的原理及其应用【大纲要求】一、掌握 PCR 技术的原理与应用。基因诊断的概念与特点;基因治疗的概念。二、熟悉 分子杂交与印迹技术。基因诊断的常用技术方法;基因治疗的基本程序。三、了解 核酸序列分析、基因文库、疾病相关基因的克隆与坚定;遗传修饰动物模型的建立及应用、生物芯片技术、蛋白质相互作用研究技术;基因诊断的应用、基因治疗的应用与展望。【重点及难点提要】一、重点难点 1重点:分子杂交与印迹技术,PCR 技术的原理。基因诊断与基因治疗的概念。2难点:PCR 技术的原理。基因诊断常用技术及治疗的基本方法。二、教学内容概要 本章概括介绍了目前医学分子生物学中有关的常用
2、技术。分子杂交技术的原理主要涉及分子杂交特性、印迹技术、探针技术。印迹技术定义为:将在凝胶中分离的生物大分子转移(印迹)或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。印迹技术包括 DNA 印迹技术(Southern blotting)、RNA 印迹技术(Northern blotting)、蛋白质印迹技术(Western blotting)。探针是指用放射性核素或其他化合物标记的核酸片段,它具有特定的序列,能够与待测的核酸片段互补结合,因此可以用于检测核酸样品中的特定基因。PCR 技术是一种在体外模拟天然 DNA 复制过程的核酸扩增技术。PCR 的基本反应步骤包括变性、退火和延伸。PCR 技术主
3、要用于目的基因的克隆、基因的体外突变、DNA 和 RNA 的微量分析、DNA 序列测定和基因突变分析等。测定 DNA 序列技术包括手工测定和自动化测定,其原理均建立在化学裂解法和 DNA 链末端合成终止法的基础之上。目前,DNA 自动测序已基本取代了手工测序。基因文库可分为基因组 DNA 文库和 cDNA 文库。基因组 DNA 文库是指包含某一个生物细胞全部基因组 DNA 序列的克隆群体,它以 DNA 片段的形式贮存着某一生物全部基因组 DNA 信息。cDNA 文库是指包含某一组织细胞在一定条件下表达的全部 mRNA 反转录而合成的 cDNA 序列的克隆群体,它以 cDNA片段的形式贮存着该组
4、织细胞的基因表达信息。目前克隆致病相关基因主要有功能性克隆和定位克隆两大策略。转基因动物、动物整体克隆技术、基因剔除技术在建立疾病的动物模型,探讨疾病的发生机制方面具有重要价值,更为重要的是可以作为新的治疗方法和新的药物的筛选系统。生物芯片技术包括基因芯片和蛋白质芯片。基因芯片主要用于基因表达检测、基因突变检测、功能基因组学研究、基因组作图、杂交测序和新基因的发现等多个方面。蛋白质芯片广泛应用于蛋白质表达谱、蛋白质功能、蛋白质间的相互作用的研究。蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括酵母双杂交、各种亲和分析、
5、荧光共振能量转换效应分析、噬菌体显示系统筛选等等。酵母双杂交系统是目前分析细胞内未知蛋白质相互作用的主要手段之一。人类大多数疾病都与基因密切相关,主要因内源基因的变异和外源基因的入侵使得基因的结构变异和表达异常所致,在基因水平诊断和治疗疾病是现代医学发展的趋势。基因诊断是指利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常,从而对疾病作出诊断的方法。常用的方法建立在核酸分子杂交和 PCR 技术的基础上。以分子杂交为基础的方法包括限制性内切酶酶谱分析法、DNA 限制性片段长度多态性分析法、等位基因特异寡核苷酸探针杂交法等。基因诊断已广泛地应用于遗传病、肿瘤、心血管疾病、
6、感染性疾病等重大疾病,除在早诊早治、疗效判断、鉴别诊断、分期分型、预测预后中发挥作用外,在判断个体疾病易感性、器官移植组织配型和法医学等方面均起着重要作用。基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内,使其在体内发挥作用,以达到治疗疾病目的的方法。目前基因治疗常用的方法有基因矫正、基因置换、基因增补和基因失活等。基因治疗根据受体细胞种类的不同分为体细胞的基因治疗和生殖细胞的基因治疗。迄今为止进行的基因治疗都是体细胞的基因治疗。目前基因治疗已逐步从实验室过渡到临床,且已取得了喜人的成绩。但基因治疗作为一种新兴的学科,尚存在许多理论和技术上的问题,有待在发展过程中进一步完善。【自测题】一、选择题【A
7、 型题】1 在加热或紫外线照射下,可导致两条 DNA 链之间的氢键断裂,而核酸分子中所有的共价键则不受影响,称为 ADNA 变性 BDNA 复性 CDNA 重组 DDNA 杂交 EDNA 退火 2DNA 变性的本质是下列哪种键的断裂 A盐键 B 氢键 C离子键 D共价键 E以上都不是 3一般影响核酸变性的温度可选在 A5060 B6070 C7080 D8090 E90100 4在核酸分子杂交时,一般对应温度作图得到的 DNA 复性曲线所用的紫外吸收值是 AOD260吸收值 BOD280吸收值 COD320吸收值 DOD360吸收值 EOD570吸收值 5鉴别 DNA 靶分子的杂交称为 ASo
8、uthern 印迹杂交 BNorthern 印迹杂交 C原位杂交 D斑点印迹 E免疫印迹 6核酸保持在细胞或组织切片中,经适当方法处理细胞或组织后,将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,称为 A原位杂交 B预杂交 C杂交前处理 DNorthern 印迹杂交 E免疫印迹 7在核酸杂交中,目前应用最为广泛的一种探针是 A基因组 DNA 探针 B寡核苷酸探针 CcDNA 探针 DRNA 探针 E克隆探针 8在 Southern 印迹杂交中,用来标记核酸探针最常用的核素是 A32P B3H C35S D125I E以上都不是 9探针是经过什么标记的核酸分子 A 用放射性同位素标记 B 用生物素
9、标记 C 用地高辛标记 D A、B、C 都对 E 用抗体标记 10以下哪种 PCR 技术,广泛应用于组织胚胎学和肿瘤学的研究 A 原位 PCR B 差异显示 PCR C 不对称 PCR D 反向 PCR E 实时 PCR 11有关 PCR 的描述,哪个不对 A 是一种酶促反应 B 引物决定扩增的特异性 C 扩增的对象是 DNA 序列 D 扩增的对象是氨基酸序列 疗的概念二熟悉分子杂交与印迹技术基因诊断的常用技术方法基因治疗的基本程序三了解核酸序列分析基因文库疾病相关基因的克隆与坚定遗传修饰动物模型的建立及应用生物芯片技术蛋白质相互作用研究技术基因诊断的应用基因点技术的原理基因诊断常用技术及治疗
10、的基本方法二教学内容概要本章概括介绍了目前医学分子生物学中有关的常用技术分子杂交技术的原理主要涉及分子杂交特性印迹技术探针技术印迹技术定义为将在凝胶中分离的生物大分子转放射性核素或其他化合物标记的核酸片段它具有特定的序列能够与待测的核酸片段互补结合因此可以用于检测核酸样品中的特定基因技术是一种在体外模拟天然复制过程的核酸扩增技术的基本反应步骤包括变性退火和延伸技术主要E PCR 技术是 1985 年由美国科学家 Kary B Mullis 建立的 12催化 PCR 的酶是 ARNA 聚合酶 BDNA 聚合酶 CTaqDNA 聚合酶 D逆转录酶 EDNA 连接酶 13PCR 产物具有特异性,是因
11、为 A TaqDNA 聚合酶保证了产物的特异性 B 适合的变性、退火、延伸温度 C 选择特异性的引物 D 引物的 Tm值不同 E 取材适当 14转基因动物时,整合到动物细胞基因组内的是 A病毒 DNA B细菌 DNA C目的基因 DrRNA EmRNA 15生物芯片技术被评为世界十大科技进展之一,是在 A1998 年度 B1988 年度 C1978 年度 D1968 年度 E1958 年度 16基因芯片显色和分析测定方法主要为 A荧光法 B生物素法 C地高辛法 D32P 法 E125I 法 17基因诊断是在基因水平上对疾病或人体状态进行诊断,下列属于基因诊断的是 A血清学诊断 B 生化诊断 C
12、 产前诊断 D 免疫诊断 E 以上都不是 18基因变异可致病,可分为内源基因变异和外源基因入侵两种,下列不属于内源基因变异的是 A基因结构突变 B基因缺失 C病原体基因入侵 D 基因扩增 E 基因表达异常 19病原体基因入侵人体主要引起哪种疾病 A遗传病 B 心血管疾病 C 糖尿病 D 高血压 E 感染性疾病 20内源基因结构突变发生在生殖细胞可引起哪种疾病?A遗传病 B 肿瘤 C 心血管疾病 D 传染病 E 糖尿病 21在下列各种基因诊断方法中,结果最为确切的是 A 基因测序 B核酸分子杂交 CPCR DRFLP EASO 22目前基因治疗中最常使用的基因载体是 A质粒 B RV C AV
13、D AAV E 酵母人工染色体载体 23将目的基因导入病变细胞,通过目的基因非定点整合,使其表达产物而补偿缺陷基因的功能或使原有功能加强的方法是 A.基因矫正 B基因置换 C基因增补 D基因失踪 E基因敲除 24利用反义核酸技术阻断某些基因的异常表达的治疗方法是 A基因矫正 B自杀基因的应用 C 基因增补 D基因敲除 E基因失活 25利用基因诊断方法对感染性疾病进行诊断主要优点是 A 诊断过程对机体没损伤 B 方便和费用低 C 可进行病因诊断 D 可以早期诊断 E以上都不是 26采用 Southern 印迹杂交进行 DNA 指纹分析,在法医中用于亲子鉴定和个体识别,分子基础是 ADNA 的多态
14、性 BRNA 多态性 C蛋白质多态性 D氨基酸多态性 EmRNA 多态性【X 型题】1下列哪些步骤属于 Southern 印迹杂交 A待测核酸样品的制备 B待测 DNA 样品的电泳分离 C凝胶中核酸的变性 DSouthern 转膜 E探针的制备 2核酸探针包括 AcDNA 探针 B基因组 DNA 探针 C寡核苷酸探针 DRNA 探针 E以上都不是 3PCR 反应体系含有 疗的概念二熟悉分子杂交与印迹技术基因诊断的常用技术方法基因治疗的基本程序三了解核酸序列分析基因文库疾病相关基因的克隆与坚定遗传修饰动物模型的建立及应用生物芯片技术蛋白质相互作用研究技术基因诊断的应用基因点技术的原理基因诊断常用
15、技术及治疗的基本方法二教学内容概要本章概括介绍了目前医学分子生物学中有关的常用技术分子杂交技术的原理主要涉及分子杂交特性印迹技术探针技术印迹技术定义为将在凝胶中分离的生物大分子转放射性核素或其他化合物标记的核酸片段它具有特定的序列能够与待测的核酸片段互补结合因此可以用于检测核酸样品中的特定基因技术是一种在体外模拟天然复制过程的核酸扩增技术的基本反应步骤包括变性退火和延伸技术主要A 耐热的 TaqDNA 聚合酶 B化学合成的寡核苷酸引物 C 4 种 dNTP D合适的缓冲液体系 E模板 DNA 4在 Sanger 双脱氧链终止法中,进行放射性标记的核素常为 A32P B125I C35S D3H
16、 E131I 5Sanger 双脱氧链终止法所需关键试剂包括 A模板 B引物 CDNA 聚合酶 D32PdNTP E32PdNTP 6下列哪种方法是基因诊断常用技术 A核酸分子杂交技术 BPCR 技术 C基因芯片 D免疫组化 E基因测序 7基因治疗中常用的基因灭活技术 A 反义 RNA 技术 B 核酶技术 C 三链技术 D 干扰 RNA 技术 E 基因矫正 8下列属于非病毒介导的基因转移技术为 A AV 介导的基因转移 B 基因枪技术 C 脂质体介导 D DEAE葡聚糖法 E RV 介导的基因转移 9关于腺病毒载体表述正确的是 A是 RNA 病毒 B基因转移率高 C位点特异性整合 D目的基因短
17、暂表达 E 可以引起免疫反应和炎症反应 10适用于基因治疗的疾病有 A 单基因遗传病 B 多基因遗传病 C传染性疾病 D肿瘤 E精神疾病 11目前基因治疗中,常用的病毒载体是 AAd 载体 B质粒 CRV 载体 DAAV 载体 E单纯疱疹病毒 12AAV 载体与其他病毒载体相比特点是 A是 RNA 病毒 B外源基因表达短暂 C基因转移率高 D外源基因相对容量较小(3.5kb)E可定点整合特定位点,稳定表达 13基因治疗中应用的治疗基因是 A 突变基因 B正常基因 C野生型基因 D抗性基因 E管家基因 14目前在临床上可作为基因治疗的靶细胞有 A淋巴细胞 B造血细胞 C肿瘤细胞 D上皮细胞 E卵
18、细胞 15目前基因治疗的方法有 A基因矫正 B基因增补 C基因置换 D应用自杀基因 E基因灭活 二、填空题 1基因变异致病的主要类型是_和_。2内源基因的变异分为_和_。3基因诊断的常用诊断技术有_、_、_和_。4对已知基因突变位点的检测需人工合成两种寡核苷酸探针,一种是与_互补的寡核苷酸,另一种是与_互补的寡核苷酸。5目前用作基因转移载体的病毒有逆转录病毒、_和_。6目前基因治疗中导入基因的方式有_和_。7在体外试验研究中,将基因导入哺乳动物细胞的方法有_和_两大类。8非病毒介导的基因转移方法可分为_和_两类。三、名词解释 1核酸分子杂交(molecular hybridization of
19、 nucleic acid)2Southern 印迹杂交(Southern blotting)3Northern 印迹杂交(Northern blotting)4原位杂交(in situ hybridization)5PCR(ploymerase chain reaction)疗的概念二熟悉分子杂交与印迹技术基因诊断的常用技术方法基因治疗的基本程序三了解核酸序列分析基因文库疾病相关基因的克隆与坚定遗传修饰动物模型的建立及应用生物芯片技术蛋白质相互作用研究技术基因诊断的应用基因点技术的原理基因诊断常用技术及治疗的基本方法二教学内容概要本章概括介绍了目前医学分子生物学中有关的常用技术分子杂交技术的
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