RNA干扰技术的特点_通信电子-WCDMA技术.pdf

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1、.v.RNAi 具有的特征 RNAi 是转录后水平的基因沉默机制；RNAi 具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个源基因的 mRNA；RNAi 抑制基因表达具有很高的效率，表型可以到达缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的 dsRNA 分子数量远远少于源 mRNA 的数量就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进展的；RNAi 抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；dsRNA 不得短于 21 个碱基，并且长链 dsRNA 也在细胞被 Dicer 酶切割为 21 bp左右的 siRNA，并由 siRNA 来介导 mRN

2、A 切割。而且大于 30 bp 的 dsRNA 不能在哺乳动物中诱导特异的 RNA 干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；ATP 依赖性：在去除 ATP 的样品中 RNA 干扰现象降低或消失显示 RNA 干扰是一个 ATP 依赖的过程。可能是 Dicer 和 RISC 的酶切反响必须由 ATP 提供能量。RNAi 的生物特性 RNAi 抑制转座子活性 两方面的证据提示转座子活性的抑制与 siRNA 有关 发现蠕虫 mut-7 基因参与 RNAi 并且与转座子的转座抑制有关;在果蝇中,参与 RNAi 的 RNA 解螺旋酶 Spindle-E 的突变将导致该基因引起的基因沉默的缺失,同

3、时提高了反转录转座子活性。RNAi 抵御病毒感染 在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现,sgs2/sde1 基因突变的拟南芥对病毒.v.的侵染表现出高度的敏感性。RNAi 参与异染色质的形成和维持 Hall 等研究说明,着丝粒同源重复序列和 RNAi 组分一起正负调节着异染色质的形成并共同促使异染色质组装成核；Vople 等在敲除裂殖酵母(S.pombe)的 RNAi途径基因(如 Argonaute、Dicer、RDRP)时发现异染色质转录得到的 dsRNA 可以在 RNAi 途径的参与下,加工成 siRNA,si RNA 募集异染色质蛋白 1(HP1),然后靶向性引起相应异染色质区域的转基

4、因沉默。RNAi 参与机体的发育调控及生理代 RNAi 只抑制转录后的基因,所以 RNAi 在生物体发育学研究中具有优势。Chuang 等用 RNAi 技术进一步证实了 AG、CLV3、AP1、PAN 等功能基因在拟南芥花发育过程中的功能。在 RNAi 过程中形成的 RISC 复合物可根据不同情况分别利用 si RNA 或 stRNA 行使不同的功能,但最终均导致特定基因沉默。1.高效性：Elbashir 等在研究中发现分别为 25 nmol/L 与 100 nmol/L 的起始双链RNA 产生的结果是一样的，只是高浓度起始的更有效些。将双链 RNA 浓度降低到 1.5 nmol/L 时产生的

5、基因沉默效果变化不大，只有当浓度降低到 0.05 nmol/L时，沉默的效果才消失。Holen 等也证实 1 100 nmol/L 的双链 RNA 浓度对基因沉默的效果是一致的。这说明双链 RNA 介导的基因沉默效率是相当高的。需要ATP：Zamore 等认为 RNAi 过程中至少有 2 个步骤需要能量的供应：一是长的双链 RNA 被 Dicer 所酶切产生双链 RNA；二是在双链 RNA 与 RISC 结合解链后形成有活性的 RISC。特异性：Elbashir 等和 Brummel kamp 等发现在 21 23 个碱基对中有 1 2 个碱基错配会大大降低对靶 mRNA 的降解效果。有很高的

6、效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相对很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源

7、重.v.位置效应：Holen 等根据人 TF(tissue factor 不同的位置各合成了 4 组双链 RNA来检测不同位置的双链 RNA 对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不同类型的细胞中，hTF167i 和 hTF372i 能够抑制 85%90%的基因活性，hTF562i 只能抑制局部基因活性，而 hTF478i 那么几乎没有抑制基因的活性。他们还以 hTF167 为中心依次相差 3 个碱基对在其左右各合成了几组双链 RNA，有趣的是它们所能抑制该基因活性的能力以 hTF167 为中心依次递减。特别是 hTF158i 和 hTF161i只与 hTF167i 相距 9 个和 6 个碱基，但

8、它们几乎没有抑制该基因活性的能力。结果还说明双链 RNA 对 mRNA 的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC 含量较低的 mRNA 被沉默效果较好。竞争效应：Hoten 等将 10 nmol/L 和 30 nmol/L 的 hTF167i 相比，两者的沉默基因效果无差异，但将 20 nmol/L 基因抑制效果很差的 PSK314i 和 10 nmol/L 的hTF167i 相混和后，hTF167i 产生的抑制效果明显降低。可传播性：在线虫中，双链 RNA 可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg 和 Hunter 在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白 SID1，它可以将双链RNA

9、 转运出细胞，因此系统性的 RNAi 包括了 SID1 介导的双链 RNA 在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的RNAi 不能扩散。植物中 RNA 干扰具有如下特点：(1)在确定基因功能时具有靶向性，在一个沉默载体中插入局部基因序列就能确定某一基因的功能；(2)能用来选择性地沉默某一基因家族中的单个基因或同时沉默一个基因家族中的多个基因；(3)PTGS 能确定在敲除后发生发育早期死亡的基因功能；(4)PTGS 具有系统性，可以通过植物的维管系统传递到植物的其它局部；(5)PTGS 易于用于大规模、高通量的系统研究。有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型

10、的程度而且相对很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.人们通过构建 RNAi

11、 文库已成功的对线虫胚胎发育进展了研究，此项工作在植物体系的研究中也正不断取得进展。1.比同源重组法更加简便，周期大大缩短。2.对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用 RNAi 技术研究它的功能。3.由于 RNAi 能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。4.R N Ai 还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用 RNAi 来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中起着关键作用。途径主要存在于细胞浆中，与反义核酸、核酶相比，具有以下特点。特异性。是严格按照碱基配对法那么与靶结合的，故只引起同源的降解

12、。研究说明，在个碱基中，错配个碱基就会大大降低干扰效应。遗传性。分子可扩散至生物体各个细胞，干扰效应可遗传给后代。研究说明，通过注射或浸泡，在二代线虫中仍可观察到对靶基因的抑制作用。但这种遗传效应可持续几代以及高等细胞中是否也存在上诉现象尚不明确。位置效应。研究说明只有针对编码区的才产生干扰效应，对含子区域的不产生干扰效应。等根据人组织因子，的不同位置合成了四组双链分别观察其干扰效应，结果显示和有的基因沉默效率，只能抑制局部基因，几乎无干扰效应。放大效应。通过实验研究发现，少量就能够使大量目的基因沉默，即使细胞增殖倍，这种沉默现象仍然存在，说明有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相

13、对很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.存在扩增机制.4 1 高度特异性当

14、一段与基因同源的 dsRNA 注射入果蝇胚胎时，它可以特异性地在果蝇体干扰靶基因的表达。而其他即使是与靶基因同属一个基因家族的基因都不会受到干扰。4 2 高穿透性 RNAi 具有距注射点远距离作用的能力。在线虫中干扰效应甚至可通过生殖系统传递到后代个体。4 3 高效率性 RNA 干扰作用是在目的基因被转录后，通过对细胞质中同源mRNA 的快速降解，最终由于该基因缺少 mRNA 而无法产生蛋白质产物。果蝇的 RNAi 实验结果在 2 3d 即可以得到结果，这是其他传统实验技术所无法比较的。4 4 高稳定性以 3端悬垂，rI碱基的 dsRNA 尤为稳定，无需像反义核酸那样进展广泛的化学修饰以提高半

15、衰期。RNAi 有以下 6 个重要特性：高特异性。特异性地抑制目的基因。RNAi 能够非常特异地只降解与其序列相应的单个源基因的 mRNA。靶序列的选择性。RNAi 的靶序列需要慎重选择，外显子序列的 dsRNA 能产生特异高效的基因抑制作用，而只具含子序列的 dsRNA 那么无此效应。高效性。RNAi 抑制基因表达具有很高的效率，可以到达缺失突变表型的程度，而且相对很少量的 dsRNA 就能完全抑制相应基因的表达。可传播和可遗传性。RNAi 抑制基因表达的效应可以在不同细胞间长距离传送和维持。在线虫中干预效应可以传递给子代。较强的稳定性。siRNA 分子 3端有突出的非配对碱基的双链分子，在

16、细胞可稳定存在 3 4 天，半衰期远长于反义寡聚核苷酸 ATP 依赖性。去除样品中的 ATP，RNAi 现象降低或消失，显示 RNAi 是一个依赖 ATP 的过程，可能与 Dicer 和 RISC 的酶切反有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相对很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子

17、活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.响必须由 ATP 提供能量有关 1 2 特征。RNAi 在转录后水平调节基因的表达，对染色体 DNA 序列的复制和转录过程不产生任何影响。高度特异性：这是 RNAi 最大的特点，导入细胞的 dsRNA 只特异性的抑制与 RNAi 同源的靶基因序列，siRNA 中只要有任何一个碱基与靶序列错配，也会明显减弱干扰效应口。高效性：相对较少的 dsRNA就可以到达明显的抑制基因表达的

18、效果，引起该基因的表型缺失突变。浓度、时间依赖性：RNAi 效应存在时间、浓度双重依赖性，干扰效应常出现在注射dsRNA 后 6 h，在注入 dsRNA 的 2 3 d 后作用最强，可持续效应 72 h 以上，而其干扰强度那么随着浓度的增高而增强。传递性和遗传性：将 dsRNA 注射于线虫体后发现，dsRNA 可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并引起其他细胞的基因沉默，说明了 RNAi 作用的可传递性。同时也发现，siRNA 介导的 RNAi 具有一定的可遗传性。将 dsRNA 注入秀丽新线虫的性腺后，在其子代中也诱导出了同样的基因抑制现象，即证明了它的遗传性。3.1

19、高序列特异性 RNAi 是转录后水平的基因沉默机制，有高度的序列特异性，19 nt 的 dsRNA 几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的 1nt 突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了，这种高度的序列特异性能够使 dsRNA 能够非常特异地诱导与之序列同源的 mRNA 降解，防止降解与目的 mRNA 同家族的其他 mRNA，从而实现对目的基因的准确沉默。因此，RNAi 具有重大的医学价值。3.2 高效性 RNAi 存在级联放大效应，由于 Dicer 酶切产生的 siRNA 与同源 mRNA 的结合并降解后者，产生新的 siRNA；新产生的 siRNA 可再次与 Dicer 酶形成RISC 复合

20、体，介导新一轮的同源 mRNA 降解的屡次利用，如此循环，使相对很有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相对很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥

21、对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.少量的 dsRNA 分子(数量远远少于源 mRNA 的数量)就能产生强烈的 RNAi 效应(每个细胞仅需几分子 siRNA 就可产生 RNAi 效应)，并可到达缺失突变体表型的程度。相比普通的 siRNA，具有短发卡构造的双链 RNA(short hairpin RNA,shRNA)产生的 RNAi 效应更强。3.3 RNAi 抑制作用迅速 RNAi 基因的表达发生在转录后，通过细胞质中同源mRNA 的快速降解，最终使该基因缺少 mRNA 而无法产生蛋白质产物。3.4 RNAi作用的靶基因位点有选择性外源性 ds

22、RNA 的转入只对成熟 mRNA 的产生作用，对 mRNA 前体没有或很少具有影响，以含子或启动子序列构成的外源dsRNA 无法引起 RNAi 效应。3.5 具有高稳定性与反义寡核苷酸不同，siRNA 是 3 端悬挂 TT 碱基的双链RNA，所以化学性质很稳定，无须象反义核苷酸那样进展广泛的化学修饰以提高半衰期。3.6 可传播性和可遗传性 RNAi 抑制基因表达的效应可以越过细胞界限，在不同的细胞间长距离传递和维持。在线虫中干预效应可以传递到子代，但这种遗传只限于子一代，子二代往往又恢复到野生型。3.7 RNAi 效应的依赖性只有连续输入dsRNA，沉默效应才能持续下去，否那么将产生短暂的沉默

23、反响，而且这种效应的强度与初始 dsRNA 的浓度有关。RNAi 是转录后水平的基因沉默机制。注射该基因的含子或启动子序列的 dsRNA都没有干预效应。翻译抑制剂对 RNAi 不产生影响。RNAi 具有较高的特异性。起初人们认为 RNAi 和 siRNA 的产生可能是序列非特异性的因为 Fire 和 Mell 发现将化学合成的 dsRNA 注入线虫体，只要当 dsRNA 大于 26bp 时就会发生 RNAi，而 dsRNA 阻断基因表达的效能与其长度呈正相关，并且不包含腺嘌呤，尿嘧啶，有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相对很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达

24、是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.或胞嘧啶的 dsI 矾 A 也可诱发 RNAi。但实际上 dsRNA 发挥干扰作用时对序列相关

25、性要求还是有较高要求的，序列不同的 dsRNA 与目标基因 mRNA 要求它们一样的连续序列长度大于 30 35nt，目标基因方可被抑制，而当该长度为 1423nt时抑制效率是非常低的，这些结果显示，使用长的 dsRNA 或是两相关序列 90同源时基因抑制将会发生。而另一方面，slRNA 假设不与 mRNA 结合其自身又是不稳定的，易于降解。这一稳定性提供了快速的特异性筛选，即不管何种来源的 dsRNA 假设细胞没有与其互补的可供抑制的 mRNA 序列与之结合，由于它的不稳定性，接下来的反响不能继续进展，反响被终止。而假设是有可结合的互补mRNA 反响那么继续进展。这些均说明 siRNA 抑制

26、基因表达是具有序列特异性的。RNAi 抑制基因表达具有高效性。极少量的 dsRNA 就能有效地抑制靶基闪的表达，RNAi 是通过自身放大机制来发挥作用【l 引，但 dsRNA 需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果。dsRNA 小片断如果小于 21 23nt，特异性将明显降低，不能保证不与细胞非靶向基因相互作用，如远远大于 21 23nt，互补序列可能延伸，超出抑制围。RN 加有浓度，时间双重依赖性。干扰效应通常出现在注射dsRNA6 小时后，可持续 72 小时以上。RNAi 基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代。RNAi 是生物基因组削弱

27、或抵抗外来遗传讯息入侵的保护性机制，已成为近年来研究基因功能、肿瘤治疗的新方法，该技术具有以下重要特征：高效性和浓度依赖性(Schneider et al，2005)，只需要少量的 siRNA 就可以引发 RNAi 现象。这是有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相对很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量

28、的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.因为整个过程中存在倍增放大机制。Martens 等在网状原虫的 RNAi 试验中敲除RrpA(RdRP 的同源体)后那么无法检测到 siRNA，但在体外系统中仍可检测到，且量非常少(Martens etal，2002)；高特异性，siRNA 具有高度特异性，只针对某一目的 RNA 或是其同源序列发挥作用。而对其他基因或是相关基因序列并没有沉默作用，这也是

29、RNAi 最大的优点，针对性强。此外与基因敲除相比，根据目标基因设计合成的 siRNA 具有高度特异性，不同 siRNA 对同一基因的沉默效果不同，从而可以模拟数量遗传性状；可遗传性，将 siRNA 植入生物体，从根本上改变了这种生物的基因组成。因此具有遗传性。Fire 等(1998)做过相关试验。将针对某基因的 siRNA 注入线虫的性腺后在其子代中同样检测不到该基因的表达。3 1 高效性 注入细胞的 siRNA 的量比细胞的 mRNA 量要少得多。但因为其自身的循环放大机制仍可对目的基因产生有效的阻断。3 2 高特异性 由 dsRNA 降解成的小的干扰 RNA，除其正义链 3 7 端的两个

30、碱基在序列识别中不起主要作用以外，其余碱基在序列识别中都是必需的。单个碱基的改变即可以使 RNAi 失效，RNAi 能特异性降解 mRNA，针对同源基因共有序列的 RNAi 那么可使同源基因全部失活。3 3 共抑制性 RNAi 是由双链 RNA 介导的转录后基因沉默机制，它的启动子相当活泼，外源基因可以转录，但不能正常积累 mRNA。RNAi 作用不仅使外源基因在转录后水平上失活，同时诱导与其同源的源基因沉默。有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相对很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离

31、传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.3 4 种属时效性 Irie 等发现在低等生物中 RNAi 可持续存在，但 RNAi 在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，一般注入 dsRNA 后的 2 3 d，RNAi

32、的作用最明显，而后 1 2 d，靶 mRNA 的丰度就能恢复到注射 dsRNA 之前的水平。这可能是由于 RNA 依赖的核苷脱氨酶脱氨基活性的逐步增高，导致 siRNA 的生成减少而受到抑制。3 5 dsRNA 的长度限制性 Dicer 酶能与 200 500 bp 围的 dsRNA 结合，底物片段越短，Dicer 酶的活性也就越弱，提示 RNAi 具有 dsRNA 片段长度限制性。RNA 干扰 RNA in e e ence，RNAi是生物基因组抵抗病毒或转座子之类的外来遗传元件入侵的一种保护性机制，RNAi 具有 4 个重要特征 11：1高效性：少量的双链 RNA sRNA就可以使相应的基

33、因表达受到抑制，即其发生过程中有正反响的信号放大效应；2高特异性：双链 RNA sRNA可以特异地降解与之序列相对应的单个源基因的 RNA,无关基因不受影响；3可遗传性及远距离效应：RNAi 基因表达的效应不仅能够传递给子一代，而且可以在同一个生物体的不同细胞甚至生物体间进展长距离的传递和维持；4 ATP依赖性：RISC 的形成和 Dice酶切割 sRNA 的过程中都需要 ATP 的参与；因此，RNA 干扰想要发生效应那么必须要依赖 ATP 的参与。3 1 高序列特异性 RNAi 是转录后水平的基因沉默机制，有高度的序列特异性，19 nt 的 dsRNA 几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的

34、 1 nt 突变后，它对基因的抑制作用就消失了，这种高度的序列特异性能够使 dsRNA 非常特异地诱导与之序列同源的 mRNA 降解，防止降解与目的 mRNA 同家族的其他 mRNA，从而实现对目的基因的准确沉默。因此，RNAi 具有重大的医学价值。有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相对很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和

35、的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.3 2 高效性 RNAi 存在级联放大效应，由于 Dicer 酶切产生的 siRNA 与同源 mRNA的结合并降解后者，产生新的 siRNA；新产生的 siRNA 可再次与 Dicer 酶形成RISC 复合体，介导新一轮的同 mRNA 降解的屡次利用，如此循环，使得相对很少量的 dsRNA 分子(数量远远少于源 mRNA 的数量)就

36、能产生强烈的 RNAi 效应，并可到达缺失突变体表型的程度。3 3 RNAi 抑制作用迅速 RNAi 发生在转录后，通过细胞质中同源 mRNA 的快速降解，最终使该基因缺少 mRNA 而无法产生蛋白质产物。3 4 RNAi 作用的靶基因位点有选择性外源性 dsRNA 的转入只对成熟 mRNA 产生作用，对 mRNA 前体没有或很少有影响，以含子或启动子序列构成的外源dsRNA 无法引起 RNAi 效应。3 5 具有高稳定性与反义寡核苷酸不同，siRNA 是 37 端悬挂 rI-I 碱基的双链RNA，所以化学性质很稳定，无须像反义核苷酸那样进展广泛的化学修饰以提高半衰期。3 1 序列上的高度特异

37、性：siRNA 与靶基因的 mRNA 在序列上严格遵循碱基配对原那么，这样就能特异性地干扰靶基因表达，而和靶基因同属一个基因家族的其他基因那么不会受到影响。3 2 抑制基因表达的高效性：RNAi 对基因表达的抑制率可达 90以上，而且仅需极少量的 dsRNA 就能产生强烈的 RNAi，这种极高的抑制效率是传统实验技术所无法媲美的。3 3 化学性质的高度稳定性：由于 siRNA 是在 3 端带有 2 个 TT 碱基的 dsRNA，所以化学性质非常稳定，不需要通过广泛的化学修饰来提高半衰期。3 4 RNAi 抑制作用的迅速性：RNAi 能快速降解胞质中的靶 mRNA，从而使靶基因无法产生蛋白质产物

38、，到达沉默靶基因的目的。有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相对很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质

39、的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.3 5 RNAi 效应的依赖性旧 J：沉默效应只有连续输入 dsRNA 才能持续下去，而且 dsRNA 的初始浓度影响 RNAi 效应的强度。3 6 RNAi 效应的可遗传性和高穿透性：dsRNA 可通过质膜、细胞间隙和细胞屏障而转运，并能在不同细胞或生物间长距离传递和维持，甚至可传给子代(线虫)。3 1 RNAi 是转录水平的基因沉默只有针对 mRNA 的基因沉默才是有效的。以含子为靶向的 RNAi 无干扰效果。3 2 高特异性 RNAi 是以 siRNA 为导向，对与 siRNA 互补的 mRNA 发挥干扰作用的。siRNA 通常只有 2125bp，

40、外源导入的 siRNA 最长有报道 29bp 的。只有在 siRNA 与靶基因完全互补配对的情况下，RISC 才能发挥作用，一个碱基的突变都可能导致干扰失效。又由于并非所有的 mRNA 位点都可以被 siRNA 干扰阻断，受体结合位点和二级构造都会影响 RNAi 效果，不当的结合位点常常导致干扰无效 24，25】。通常一段 siRNA 只能干扰一种或一类基因，因此具有高特异性。3 3 高效性通过对 RNAi 的机制的了解可以看出，一个起始 siRNA 在与靶基因结合后即可以在 RISC 作用下把靶基因降解成大量新的 RNA 片段，自身又可以在 RDR 的作用下复制扩增，形成干扰回路，使干扰效果

41、成指数倍增长。3 4 系统性在植物中，RNAi 信号可以通过胞问连丝和筛管进展细胞间短距离和长距离的传递，从而是干扰扩散到整个组织或植株。动物细胞中 RNAi 信号可以在相关跨膜蛋白介导下形成跨膜通道，到达扩散效果。线虫中发现的由 sidl 基因编码 SID 1 蛋白即是一种与沉默信号相关的跨膜蛋白 26。哺乳动物中也发现有 SID 1 蛋白同源物【15。病毒引起的外源 RNAi 甚至是可以遗传的。RNAi引导和控制的组蛋白修饰及异染色质状态也被认为可以遗传。3 5 显效快对哺乳动物细胞注入 siRNA，在数分钟即可发现干扰现象，在 2 3h有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相对

42、很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.是效果最为显著。通常在 1-2d后干

43、扰现象完全消失。通过病毒载体介导 RNAi，可以使干扰效果持续 lm。3。l RNAi 现象具有种族特异性 Barstead 等【l在 dsRNA 转染实验中发现，未分化胚胎干细胞 RNAi 现象明显，而分化胚胎细胞中那么不明显或仅能检测到微弱的效应。Miyagishi 等 111 利用 u6 启动子合成 3末端 4 个尿苷酸突出的 siRNA基因沉默，实验证实 siR NA 效应依赖于靶序列，并与其二级构造 RNA 结合蛋白质存在与否有关。用与同一转录的不同靶区为模板可能产生不同的抑制水平。Rnase家族具有保守的序列也决定被裂解成的 siRNA 同样具有种族特异性。3 2 RNAi 具有高

44、效率性 RDRP 等类似物的存在使 RNAi 效应呈级量增长，比单纯用正义或反义 RNA 效应增强达数十倍之多。在线虫、西红柿、真菌、拟菌芥等生物中都发现了 RDRP 的同源物，并证实它们都参与 RNAi。虽然在人体未发现类似果蝇同源物，但可能有其替代物存在。让许多科学家感到欢欣鼓舞的是，极少量的 dsRNA 便可封闭整个基因。RNAi 效应可由注射部位传递到整个机体并进人生殖腺，传递给子代。3 3 RNAi 技术具高成功率线虫全基因组于 1998 年测序完毕，大局部基因的功能是通过 RNAi 的方式进展破译的。50一 80序列RNAi 技术有效引。与反义核苷酸技术及基因敲除相比具有更简易、方

45、便的特点。以前研究一个基因需要几个月的时间，但现在那么只需数天时间。利用媒介合成的 siRNA 可使 CHD。蛋白减少超过 90。RNAi 可以非常简单地代替基因敲除来制备特定基因缺失表型的个体，并研究该基因的功能。RNAi 是发生在转录后水平的基因沉默。dsRNA 具有很高的特异性，能特异地将与其同源的 mRNA 降解。Andrew 在植物中用 3 种转基因诱导的转录后的基因沉默(PTGS)都检测到有约 25 nt(nucleotide)长的 siRNA(short interferenceRNA)。Shi 有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相对很少量的分子数量远远少于源的数量

46、就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.Chenyang 等从已转染 dsRNA 的未分化的胚胎干细胞、卵母

47、细胞以及老鼠胚胎细胞的细胞质提取物中都发现有 21 23 nt 长的 siRNA。这些 siRNA 可能具有指导核酸酶特异地识别靶 mRNA 而将其降解的功能，21 23 nt 以下的片段还没有发现，由于这些片段不稳定，易被胞其他核酸酶降解。极低浓度的 dsRNA 就能完全抑制基因的表达。这可能由于 RNA 存在复制或由于 dsRNA 具有很强的催化功能。dsRNA 抑制效应具有传递性。Timmons 等用含目的基因表达 dsRNA 载体大肠杆菌喂养线虫，RNA 从肠中吸收，但在体细胞及生殖细胞中都有分布表达。此外，RNAi 不仅发生在亲代动物本身，其子代伴随基因表达过程也产生了强烈而特异的抑

48、制效应。细胞的这种抑制能力还能在细胞与细胞之间通过胞间连丝传递，甚至可以通过植物的维管组织在整个植物体中传递。Jorgenese 等将有共抑制现象的植物作为砧木，没有抑制现象的植物作为接穗，一段时间以后在接穗中产生了共抑制现象。说明有某种信号分子通过植物的维管系统进展传递，由于这种系统获得的沉默具有序列特异性的特点，这种信号分子可能是一种 RNA 与蛋白质的复合体。dsRNA 模板有选择性。对不同目的基因构造序列而合成的 dsRNA所产生的抑制效应存在显著差异。Fire 等发现，基因外显子编码区的 dsRNA 能够产生特异和高效的抑制作用，而人对应于含子和启动子序列的 dsRNA 不能发生可检

49、测的抑制效应。高稳定性：以 3末端突出的 TT 碱基的 dsRNA 尤为稳定。无需象反义核酸那样进展进展广泛的化学修饰以提高半衰期。高效率：在低于反义核酸几个数量级的浓度下，就能使目标基因的表达降到极低水平甚至完全抑制从而产生缺失突变体表型。高特异性：siRNA 除正义链 3末端突出的 2 个碱基在序列识别中不起主要作用有很高的效率表型可以到达缺失突变体表型的程度而且相对很少量的分子数量远远少于源的数量就能完全抑制相应基因的表达是以催化放大的方式进展的抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持信号甚 大于的不能在哺动物中诱导特异的干扰而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋

50、亡依赖性在去除的样品中干扰现象降低或消失显示干扰是一个依赖的过程可能是和的酶切反响必须由提供能量的生物特性抑制转座子活性两方面的 变将导致该基因引起的基因沉默的缺失同时提高了反转录转座子活性抵御病毒感染在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性参与异染色质的形成和维持等研究说明着丝粒同源重.v.外 其他单个碱基的改变均可能使 RNAI 效应大大减弱。而针对同源基因共有序列的 RNAi 那么导致同源基因共同失活。高传递性：RNAi 抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限在不同细胞问长距离传递和维持。在某些生物中 RNAi 还可以传递到后代中去。2 1 RNA