PCR引物设计及软件使用技巧.pdf

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1、PCR 引物设计及软件使用技巧 张新宇，高燕宁*（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京 100021）摘 要：本 文旨在介绍使用软件设计 PCR 引物 的技巧。在 PCR 引物设计 原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而 引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。关键词：PCR；引物设计 中图分类 号：Q524 To design PCR primers with Oligo 6 and Primer Premier 5 Zhang Xinyu,Zhu Youk

2、ang,Gao Yanning(Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing,100021,China)Abstract:The skill of PCR primer design with software is introduced in this paper.Based on the principal of PCR-primer design,the usage of two kinds of popular primer-design software was reviewed detailedly,inc

3、luding their merit,demerit and usage skills.It is recommended that to use Premier Primer 5 does the usual automatic primers search,but Oligo 6 primers analysis.Key Words:PCR primer;design;usage skill;自从 1985 年 Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一1，而引物设计是 PCR 技 术中至关重要的一环。使用不合适的 PC

4、R 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出 带或出带很弱，等等。现在 PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行 PCR引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。1.引物设计的原则 引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再 次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合 反应(即错配)。具体实现这 3 条基本原则 需要考

5、虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长 度 1（product length），序列 Tm 值(melting temperature)，引物与 模 板形成双链 的内部稳定 性(internal stability,用 G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必 要时还需对 引物进行修 饰，如增加 限制性内切 酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的

6、总结，引物设计应注意如下要点：1.引物的长度一般为 15-30 bp，常用的 是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长 会导致其延伸温度大于 74，不适于 Taq DNA 聚 合酶进行反应2。2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3端相似性较高的序列，否则容易 导致错配。引物 3 端出现 3 个以上的连 续碱基，如 GGG 或 CCC，也会使错误引发机率增加2。3.引物 3 端的 末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错 配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为 A 的错 配效率明显高于其他 3 个碱基，因此应当避免在引物的 3 端使 用碱基 A

7、34。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致 PCR 反应失败。5 端序列对 PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物2。4.引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大25。5.引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72 左右 可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式 Tm 4(G+C)2(A+T)，在 Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)67。6.G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3 端 G 值

8、较低（绝对值不超过 9），而 5 端和 中间 G 值相对较高的引物。引物的 3 端的 G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应6。7.引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能 正常进行8。8.对引物的修饰一般是在 5 端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如 GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的 PCR 因为产物序列相对固定，引物设计的选择自

9、由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。2.引物的自动搜索和评价分析 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件 在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都 带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人

10、工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。22.1 Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 2.1.1 功能“Premier”的主要 功能 分四大 块，其中有 三种 功能比 较常 用，即 引物 设计()、限制性内切酶位点分析()和 DNA 基元(motif)查 找()。“Premier”还具有同源性分析功能（），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其 中最 重要 的是设 计 简并引物，另 外还 有序列“朗 读”、DNA 与

11、蛋白 序列 的互换（）、语音提示键盘输入（）等等。有时需要根据一段氨基酸序列反推到 DNA 来设 计引物，由于大多数氨基酸（20 种常 见结构氨基酸中的 18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推 DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可 以针对模板 DNA 的来 源以相应的遗传密码规则转换 DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有

12、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动 物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支 原 体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标 准（Standard）、脊椎动物线粒体（Ve r t e b r a t e Mitochondrion）和酵母线 粒体（Yeast Mitochondrion）。2.1.2 使 用 步 骤及技 巧“Premier”软件启动界面如下：其主要功能 在主界面上 一目了然（按钮功能如 上述）。限制 性酶切点分

13、 析及基元查 找 功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按确定 即可。常见 的限制性内 切酶和基元 一般都可以 找到。你还 可以编辑或 者添加新限制性内切酶或基元。进行引物设计时，点击 按钮，界面 如下：3 进一步点击 按钮，出现“search criteria”窗口，有 多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序 引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索 类型(Search Type)可选择 分别或同时查找上、

14、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或 Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引 物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按，随之 出现的 Search Progress 窗 口中显示 Search Completed 时，再按，这时搜索结果以表格

15、的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认 显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排 列，满 分为 100，即各 指标基本都能达标（如下图）。4 点击其中一对引物，如第 1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示：该图分三部分，最上面是图示 PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错 误 引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Di

16、mer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由 变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是 最下面的分 析栏没有，只有。值得 注意的是中 间一栏的末 尾 5给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。在需要 对引 物进行 修饰 编辑时，如 在 5 端加入 酶切位 点，可点击，然 后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击 按钮。如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至 DNA 序列即 可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索

17、功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，是一个相当不错的软件。2.2 Oligo 6.22 使用技巧简介 2.2.1 功能 在专门的引 物设计软件 中，“Oligo”是最著名的。它的使用 并不十分复 杂，但初学 者 容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和G 图；Oligo 6.22 的界面更复杂，出现三个图，加了个 Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。2.2.2 使用（以 Oligo 6.22 为例）Oligo 6.22 的 启动界面如下：图中显示的三个指标分别为 T

18、m、G 和 Frq，其 中 Frq 是 6.22 版本的新功 能，为邻近 6至 7 个碱基 组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的 cascade 排列 方式不太方便，可从 windows菜单改为 tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如 Frq，这样界面的结构同于 Oligo 5.0，只是显 示更清楚了。经过 Windows/Tili 项后的 显示如图：6 在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击 Tm 图块 上左下角的 Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已

19、选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成 Lower。G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的 G 值在 5 端和中间值比较高，而在 3 端相对低（如图：）Tm 值曲线以 选取 72 附 近为佳，5 到 3 的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用 3 端 Frq 值相对较低的片段。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是 3端 二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自 身形成，也 有可能是在 上下游引物

20、之间形成（cross dimer）。二聚体形成 的能值越高，越不 符合要求。一般的检测（非克隆）性 PCR，对 引物位置、产物大小要 求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过 4.5 为好。当然，在设计克隆目的的 PCR 引物 时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种 PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为 GC 含量，以 45-55 为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高

21、，导致引物的 GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的 GC 含量以及 Tm 值保持接 近，以有利于退火温度的选择。如果 PCR 的模板不是基因组 DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行 False priming site 的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发 PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的 PCR 结果。一 般在错配引发效率以不超过 100 为 好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为 450 以上，而 在错误位点的引发效率为 130，那么 这对引物

22、也是可以接受的。当我们结束以上四项检测，按 Alt+P 键弹出 PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等 参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并 7 8不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由 Whitehead Institute 开发的“Primer 3”等（本网站 http:/210.72.11.60

23、 已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该软件的独特之处在于，对全基因组 PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组 PCR 的用 户试用。参考文献（References）：(1)H.A.艾 得 希主编,田丁 等译.PCR 技 术DNA 扩增的原 理与 应用.北京:北 京医科大 学中 国协和医科大 学联 合出版社,1991.(2)林万明 著.PCR 技术 操 作与应用 指南.北京:人民军 医出版社,1993.(3)朱平主 编.PCR 基因 扩 增实验操 作手 册.北京:中 国科学技 术出 版社,1992(4)郑仲承.寡核苷酸

24、的优 化设计.生 命 的化学,2001,21(3):254256.(5)George H.Keller Mark M.Manak.DNA probes.1992.(6)Oligo 软件 帮助文件(Oligo.HLP).(7)Martin,F.H.,Castro,M.M.,and Tinoco,Jr.I.Base pairing involving deoxyinisine,implications for probe design.Nucleic Acids Res,1985,13:89278938.(8)Rychlik,W.and Rhoads,R.E.A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization,sequencing and in vitro amplification of DNA.Nucleic Acids Res,1989,17:85438551.