基因克隆酶切位点的保护碱基表.pdf

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1、本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如 AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被

2、限制性核酸内切酶切开，因此在设计 PCR 引物时，人为的在酶切位点序列的 5 端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的 Tm 值和各引物的碱基分布及 GC 含量。如果某条引物 Tm 值偏小，GC%较低，添加时多加G 或 C，反之亦反。为了解不同内切酶对识

3、别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上 6 个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用 -32PATP 在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A260单位的寡核苷酸。取 1g 已标记了的寡核苷酸与 20 单位的内切酶，在 20C 条件下分别反应 2 小时和 20 小时。反应缓冲液含 70mM Tris-HCl(pH 7.6),10 mM MgCl2,5 m

4、MDTT 及适量的 NaCl 或 KCl（视酶的具体要求而定）。20%的 PAGE（7M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。基因克隆酶切位点的保护碱基表基因克隆酶切位点的保护碱基表本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。酶 寡核苷酸序列 切割率%2 hr 20 hr Acc I GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 0 0 0 0 0 0 Afl III CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 0 90 90 0 90 90 Asc I GGCGCGCC AGGCGCG

5、CCT TTGGCGCGCCAA 90 90 90 90 90 90 Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 50 90 90 90 90 90 BamH I CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 10 90 90 25 90 90 Bgl II CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 0 75 25 0 90 90 BssH II GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 0 0 50 0 0 90 BstE II GGGT(A/T)ACCC 0 10 BstX I AACTG

6、CAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 0 25 25 0 50 90 Cla I CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 0 0 90 50 0 0 90 50 EcoR I GGAATTCC CGGAATTCCG 90 90 90 90 CCGGAATTCCGG 90 90 Hae III GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA 90 90 90 90 90 90 Hind III CAAGCTTG CCAAGCTTGG

7、CCCAAGCTTGGG 0 0 10 0 0 75 Kpn I GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 0 90 90 0 90 90 Mlu I GACGCGTC CGACGCGTCG 0 25 0 50 Nco I CCCATGGG CATGCCATGGCATG 0 50 0 75 Nde I CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 0 0 0 0 75 75 0 0 0 0 90 90 Nhe I GGCTAG

8、CC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 0 10 10 0 25 50 Not I TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 0 10 10 25 25 0 10 10 90 90 Nsi I TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 10 90 90 90 Pac I TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG 0 0 0 0 25 90 Pme I GTTTA

9、AAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC 0 0 0 0 25 50 AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 75 90 Pst I GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 0 10 90 90 0 0 10 90 90 0 Pvu I CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 0 10 0 0 25 10 Sac I CGAGCTCG 10 10 Sac II GCCGCGGC TCCCC

10、GCGGGGA 0 50 0 90 Sal I GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 0 10 10 0 50 75 Sca I GAGTACTC AAAAGTACTTTT 10 75 25 75 Sma I CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 0 0 10 90 10 10 50 90 Spe I GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG 10 10

11、 0 0 90 90 50 50 Sph I GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT 0 0 10 0 25 50 Stu I AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT 90 90 90 90 90 90 注释：1如果要加在序列的 5端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的 5端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在 3 端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的 3 端加上相应的碱基（黑色）。2切割率：正确识别并酶切的效率 3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。Xba I CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG 0 90 75 75 0 90 90 90 Xho I CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG 0 10 10 0 25 75 Xma I CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA 0 25 50 90 0 75 90 90