2023年ICU患者支气管肺泡灌洗液采集、送检、检测及结果解读规范.docx

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1、2023 年 ICU 患者支气管肺泡灌洗液采集、送检、检测及结果解读标准全文支气管肺泡灌洗液 bronchoalveolar lavage fluid ，BALF 的标准化采集和送检流程， 是获得正确 BALF 微生物学和细胞学结果的前提， 而通过不恰当的操作方式获得的结果易误导临床诊疗。 1999 年欧洲呼吸学会公布了 “支气管肺泡灌洗技术标准化操作和非细胞成分检测指南“，2023 年美国胸科医师协会公布了“BALF 的细胞学分析在肺间质性疾病中的临床应用 “，2023 年中华医学会呼吸病学分会公布了“肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识“，均对支气管肺泡灌洗标准化操作流程提出

2、具体指导意见，但上述指南或共识并不适用于重症监护病房 intensive care unit ，ICU 这一特别医疗单元， 亟需制定针对 ICU 危重症患者的 BALF 标本留取、送检及临床应用的操作标准。为此，中华医学会呼吸病学分会呼吸危重症医学学组及中国医师协会呼吸医师分会危重症医学工作委员会联合制定了本标准， 以期为 ICU 患者的 BALF 采集、送检及临床应用供给标准化流程。一、适应证与禁忌证一适应证1. 危重症患者支气管 -肺疾病的诊断及鉴别诊断。2. 明确重症肺炎的病原学。3. 明确支气管 -肺部疾病的病因、发病机制等需要猎取标本者。4. 下呼吸道疾病的内镜治疗气道堵塞，黏痰或痰

3、栓的去除等。二禁忌证危重患者承受支气管镜下肺泡灌洗无确定禁忌证。相对禁忌证如下， 并建议有阅历的医师进展操作。1. 严峻的低氧血症：鼻导管吸氧、面罩吸氧、经鼻高流量氧疗及无创呼吸机的患者吸氧浓度 FiO 2 为 0.91.0 不能维持脉搏氧饱和度 90% ； 经气管插管机械通气患者呼气末正压 15 cmH 2O(1 cmH 2O=0.098 kPa) ；气道峰压 35 cmH 2O 或 PaO2/ FiO 2 比值80 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa) ，气管插管内径过小 7 mm 。2. 心血管病急重症： 4 周内急性冠脉综合征、恶性心律失常、急性心力衰竭、血液动力学不稳定尽管应

4、用血管活性药物仍表现为平均动脉压0.15 gkg-1min -1 或多巴酚丁胺5 gkg-1min -1。以上状况原则上应推迟支气管镜操作。3 凝血功能紊乱： 血小板计数 3，凝血酶原时间 PT或活化局部凝血活酶时间APTT 大于 1.5 倍正常值。以上状况建议输注血小板或血浆后行支气管镜操作。4颅内高压 20 mmHg 、癫痫、颈椎不稳、气道痉挛、上腔静脉堵塞综合征、主动脉瘤等，应选择深度冷静或全身麻醉下操作。 5近期大咯血者假设未行支气管动脉栓塞，有再次大咯血风险者。二、支气管肺泡灌洗围操作期工作(一消毒与防护1. 环境消毒：地面应用400700 mg/L 有效氯的含氯消毒液擦拭， 作用时

5、间 30 min 。2. 物品消毒：物体外表使用 400700 mg/L 有效氯的含氯消毒液或1 0002 000 mg/L 季铵盐类消毒液擦拭，有条件时可使用消毒湿巾擦拭,尤其是患者和医务人员双手高频接触的环境外表如病床栏杆、床边桌、呼叫按钮、监护仪、微量泵、床帘等。3. 针对如型冠状病毒等具有高危传播风险感染患者进展检查前肯定要进展充分风险评估，如需要操作建议在负压病房进展，依据三级防护级别佩戴 N95 口罩，一次性防护服加防渗透隔离衣，2 层乳胶手套， 2 层鞋套，全面型呼吸防护器或正压式头套进展操作。(二物品预备1常规物品：无菌隔离衣、无菌手套、无菌治疗巾； 无菌石蜡油、灭菌注射用水

6、500 ml、酶洗液；注射用盐酸丁卡因50 mg、2%盐酸利多卡因或2%盐酸利多卡因凝胶、雾化器、麻醉喷壶、常用冷静药物如右美托咪定、丙泊酚等； 0.9% 氯化钠 100 ml 、0.12% 洗必泰或无菌生理盐水、0.12% 氯已定溶液、 10 ml 及 20 ml 注射器、负压吸引器、一次性无菌集痰器、一次性使用牙垫、一次性口腔护理包、紫外线灯、500mg/L 或 1000 mg/L 含氯消毒剂或消毒湿巾等。2抢救物品：监护室急救物品车配备常规抢救用药物器械等。(三患者预备1根底预备：符适宜应证患者由患者本人或授权家属签署知情同意书，有相对禁忌 证者依据病情酌情进展预处理；冷静患者建立中心静

7、脉通路。2. 围操作期预备：1消化道预备：自主进食者需术前46 h 禁食，留置鼻胃管者术前 4 h 停鼻饲， 留置空肠养分管者术前 0.5 h 停鼻饲， 深冷静richmond agitation-sedation scale，RASS 评分30% ，灌洗时间掌握在 5 min 以内为宜。4. BALF 收集：为避开灌洗液细胞黏附造成损失，建议选用有机硅涂层玻璃或聚丙烯容器收集。第 1 管 BALF 可能混有非病变处病原菌，影响检测结果，建议单独处理作为临床参考依据，第2 管送检病原微生物检验，第3 管送检细胞计数及分类，其余依据临床需要进展送检。三留意事项1. 对于初次检查或病情稳定者， 先

8、对各主要叶段支气管进展快速检查，再进入目标肺段进展灌洗操作；而病变位置明确或病情危重者，直接进入目标肺段进展灌洗。尽量削减在未到达目标肺段前进展吸引，避免非病变部位的气道分泌物造成污染。2. 支气管镜进入目标肺段灌洗时嵌顿要适度，假设嵌顿不佳，可造成灌洗液外溢至其他部位， BALF 回收量削减；假设嵌顿过度，可造成气道黏膜损伤及负压回收时气管塌陷不能顺当回收，影响回收率。3. 为避开口咽部和气管支气管非病变处病原菌对BALF 的污染，有条件可行保护性肺泡灌洗图3。保护性肺泡灌洗操作如下：当支气管镜送达目标支气管段开口后，经操作孔道插入专用保护性带气囊双管腔导管，导管前端予可溶性管塞封堵常用聚乙

9、二醇，防污效果好， 且易被肺部吸取，伸入目标亚段，向气囊管腔注入1.52 ml 的气体使其充盈，封堵目标段或亚段支气管管腔，实现最正确闭塞，再经保护性远端导管推注少量生理盐水，冲掉导管头部的可溶性管塞，用20 ml 注射器每次注入 37 生理盐水 1020 ml 进展保护性支气管肺泡灌洗，用注射器手工回收BALF 。图 3 支气管镜及保护性远端导管A，支气管镜前端在目标肺段， 带气囊的导管楔入灌洗肺段B4. 操作过程严密监测患者生命体征、SpO 2、呼吸机参数指标；动作轻柔，充分麻醉， 避开猛烈咳嗽或负压过大损伤支气管引起黏膜出血， 导致 BALF 红细胞过多对检测结果产生影响。负压吸引保持在

10、100mmHg 以下，并避开消灭明显的气道塌陷。四、支气管肺泡灌洗的并发症及处理支气管肺泡灌洗并发症分为术中并发症和术后并发症，术中并发症主 要包括低氧血症、出血、气道痉挛、喉头水肿、心脏及血流淌力学并 发症等，术后并发症常见为发热。一术中并发症1低氧血症：1面罩吸氧和高流量氧疗患者：SpO 290% ，30 s 后仍未到达目标氧饱和度者应退镜中止操作，待SpO 2 上升至 90% 或更换为无创正压通气条件下再行肺泡灌洗。 2无创正压通气患者： SpO 290% 时 FiO 2 上调至 1.0 、EPAP 上调 24 cmH 2O；假设 SpO 280% 超过 1 min ，退镜中止操作。Sp

11、O 2 持续 85% 需气管插管机械通气。3有创机械通气患者： SpO 290% 时，保证 FiO 2 为 1.0 ，增加 PEEP ；SpO 280% 超过 1 min ， 退镜中止操作，但非确定禁忌证。2. 出血：1无人工气道患者： 少量出血30 ml ：减小回抽负压100 ml：头低位并出血侧卧位，经支气管镜注入冰盐水、肾上腺素或凝血酶，快速吸引，去除血凝块，垂 体后叶素雾化或静滴。假设活动性出血未能停顿或消灭低氧血症，马上 予双腔气管插管或健侧气管插管单侧肺通气。必要时球囊填塞止血、支气管动脉栓塞或外科手术治疗。 2有人工气道患者：少量或中等量出血：处理同无人工气道患者。大量出血：头低

12、位，调整气管插管位置，行健侧肺通气。快速抽吸，去除凝血块，药物止血。出血 仍未停顿者球囊填塞止血、支气管肺动脉栓塞或手术治疗。3. 支气管痉挛：1非有创机械通气患者：马上退镜，FiO 2 调至 1.0，药物救治：雾化吸入沙丁胺醇 2.5 mg 、异丙托溴铵 0.5 mg 、布地奈德 12 mg 等药物；未缓解者静脉赐予甲泼尼龙4080 mg ，极重度哮喘发作患者甲泼尼龙剂量可增加至160320mg/d 。持续未缓解或SpO 2 持续85% 者需气管插管有创正压通气。2有创机械通气患者：首选P-SIMV+PSV 模式，参数： FiO 2 为 1.0 ，吸呼比 13，慢呼吸频率612 次/min

13、，小潮气量为 610 ml/kg ，PEEP 为 0 cmH 2O，维持SpO 2 为 90%95% ；支气管舒张剂用法同无人工气道患者。气道痉挛仍未缓解者赐予适当冷静、肌肉松弛。4. 喉痉挛及喉头水肿：非有创机械通气患者：马上退镜中止操作，雾化吸入布地奈德或复方 异丙托溴铵，未缓解者静脉赐予糖皮质激素。假设持续加重或消灭低氧 血症，予气管插管机械通气。气管插管困难者紧急行环甲膜穿刺或气 管切开。5. 心血管并发症：1非有创机械通气患者：退镜中止操作。心律失常常见窦性心动 过速、室上性心动过速、房颤、心动过缓：FiO 2 上调至 1.0 ，3 min 仍未好转者复查心电图针对性处理。低血压：补

14、液，静脉予去甲肾上腺素起始剂量 0.15 gkg-1min-1、多巴胺救治起始剂量 5 gkg-1min-1，正在使用血管活性药物患者适当增加剂量。存在缺血性心脏病如心肌梗死根底疾病患者，适度冷静。心跳骤停极其罕见：心肺复苏，紧急气管插管。紧急呼叫专科处理。 2有创机械通气患者：退镜中止操作，心律失常处理同非有创机械通气患者。低血压：停用冷静剂，降低 PEEP ，补液、静脉赐予去甲肾上腺素或多巴胺。心肌缺血加重者，降低平均气道压和 PEEP ，应用硝酸酯类药物扩张冠状动脉。二术后并发症主要为发热，常见缘由为肺炎和血流感染，亦可见于吸取热。完善床旁 X 线胸片、血细菌真菌培育、血常规、CRP 、

15、PCT 检查。如 X 线胸片觉察灌洗部位发炎症转变或原有感染范围扩大，提示可能有的感染，依据 BALF 快速病原学检查结果调整抗感染方案。血培育阳性提示为血流感染，依据BALF 病原学及血培育结果调整抗感染方案。五、支气管肺泡灌洗液的标本评价一 BALF 离心和涂片标本猎取后需马上观看灌洗液的性状和量，如含有黏液成分的标本，可用无菌纱布过滤或使用 0.1% 二硫苏糖醇进展溶解。 溶解方法： 一般选择 0.5 ml 的 0.1% 二硫苏糖醇与 2 ml 的 BALF 混合配制比例约为14，灌洗液黏液成分较多， 可适当提高比例。溶液混合后，于 37 放置 510 min ，一般可以完全溶解。溶解液

16、30 min 内完成离心及制片。灌洗液标本中细胞及微生物含量少，如需观看细胞、细菌形态及含量可应用离心机进展 1 600 g 离心 10 min g=r11.18 10-6 rpm 2后弃上清液，留取 0.3 ml 的 BALF ，用移液枪混匀。 选取 20 l 滴注在载玻片的中心，以画圈的方式涂出面积大小约 1 cm2 的标本涂片 2 张。标本涂完后宜放置于室温，自然枯燥。涂片应在生物安全柜内操作。涂膜要厚薄适宜，且分布均匀图 4。图 4 BALF 标本载玻片示意图二染色1常用染色方法包括迪夫快速染色Diff-quickstain ，革兰染色 Gramstain ； 特别染色包括六胺银染色

17、Hexaminesilver staining 、墨汁染色 India ink staining 等。 1迪夫快速染色：迪夫 ADiff quik A 溶液，主要成分为曙红、甲醇；迪夫BDiff quik B溶液，主要成分为亚甲蓝；磷酸盐缓冲液，主要成分为磷酸盐。分别把迪夫A 溶液、迪夫 B 溶液、磷酸盐缓冲溶液适量倒于带盖的染缸中； 把枯燥后的玻片浸泡在迪夫A 溶液中 2030 s ；于磷酸盐缓冲溶液中洗掉迪夫A 溶液，稍甩干缓冲液；再把涂片浸泡于迪夫 B 溶液中 2030 s；水洗、枯燥、镜检。 2革兰染色：革兰染色一般包括初染、媒染、脱色、复染等4 个步骤，具体操作方法是：涂片、枯燥同上

18、，固定方法：常用高温进展固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，将涂有标本的载玻片快速来回通过酒精灯外焰34 次，共约 34 s，冷却后进展染色。要求玻片温度不超过 60 ， 以玻片反面触及手背皮肤不觉过烫为宜；也可选择丙酮固定。草酸铵结晶紫染 1 min 后自来水冲洗； 加碘液掩盖涂面染约 1 min 后自来水冲洗；加 95% 酒精数滴，并轻轻摇动进展脱色， 30 s 后自来水冲洗；蕃红染色液稀染 30 s 后，自来水冲洗。枯燥，镜检。三标本评价1. 合格 BALF 标本为低倍镜下鳞状上皮细胞占全部细胞 不包括红细胞的比例 1% ，柱状上皮细胞 5% 时，红细胞 85% ，淋巴细胞 10%15%

19、 ，中性粒细胞 3%，嗜酸粒细胞 1%，鳞状上皮细胞或纤毛柱状上皮细胞均5%。安康吸烟者的BALF 中细胞总数明显增高，一般为不吸烟者的35 倍，增多的细胞主要为肺泡巨噬细胞和中性粒细胞。四标本快速现场评价1. 细胞学评价可使用迪夫快速染色，优点包括不需要马上固定，细胞损失少。染色过程简洁、 快速，且更简洁识别细胞质和内含物 图 1。1淋巴细胞 15% ：提示结节病、非特异性间质性肺炎、过敏性肺炎、药物性肺炎、胶原血管病、放射性肺炎、隐源性机化性肺炎、淋巴增殖性病变等。其中当淋巴细胞计数 25% 时提示肉芽肿性疾病结节病、过敏性肺炎或慢性铍病、非特异性间质性肺炎、药物反响、淋巴间质性肺炎、隐源

20、性机化性肺炎或淋巴瘤， 当淋巴细胞计数 50% 时猛烈提示过敏性肺炎或富细胞型非特异性间质性肺炎。 2中性粒细胞3% ：提示胶原血管病、特发性肺纤维化、吸入性肺炎、细菌或真菌感染、支气管炎、石棉肺、急性呼吸窘迫综合征ARDS 、布满性肺泡损伤等。其中当中性粒细胞计数50% 时常猛烈提示急性肺损伤、吸入性肺炎或化脓性感染。3嗜酸粒细胞 1% ：提示嗜酸粒细胞肺炎、药物性肺炎、骨髓移植、哮喘、支气管炎、变应性肉芽肿性血管炎、过敏性支气管肺曲霉菌病、感染细菌、真菌、蠕虫、肺孢子虫、霍奇金病。另外，嗜酸粒细胞计数是否 25% 可鉴别急性或慢性嗜酸粒细胞肺炎。 4当肥大细胞 1% 、淋巴细胞 50% 和

21、中性粒细胞 3% 时，猛烈提示急性过敏性肺炎。 5如见中性粒细胞或巨噬细胞吞噬病原微生物现象，需报告吞噬细胞所占同种细胞百分比，吞噬比例大于5%提示感染，吞噬病原菌为致病菌。2. 微生物学评价可使用革兰染色或迪夫快速染色图5。有阅历的医师可区分出常见的真菌和局部细菌。如念珠菌，曲霉，毛霉，隐球菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌和 鲍曼不动杆菌等，假设结合特别染色识别率更高。图 5 BALF 标本快速现场评价方法。 图 A 和图 C 为迪夫快速染色低倍放大，图 B 和图 D 为革兰染色高倍放大，箭头为中性粒细胞吞噬现象3. 承受二步法观看涂片：先用低倍镜40 或 100

22、倍扫描全片，观察是否存在可疑细胞、粗大菌丝，再用高倍镜400 或 1 000 倍作细胞分类、鉴定细胞性质、观看微生物形态、推断微生物数量及有无中性粒细胞吞噬现象图5A 和图 5D。五 BALF 淀粉酶BALF 淀粉酶浓度随误吸危急因素的数量增加而增加，BALF 淀粉酶浓度超过 125.9 U/L 可以高度疑心发生误吸，且浓度高于125 U/L 患者的细菌性肺炎患病率明显增加。BAL 淀粉酶有一个相对较长的检测窗口，即误吸后 72 h 以内仍可检测到上升的淀粉酶。六、BALF 的保存及送检对于 ICU 患者的 BALF 标本，建议使用有机硅涂层玻璃或聚丙烯或其他用于悬浮组织培育的塑料无菌容器收集

23、。送检量一般需要5 ml， 建议 1020 ml。冠肺炎等烈性呼吸道传染病患者BALF 标本要严格依据生物安全有关要求对样品进展包装盒运送，需要时，运送箱的外表可用有效氯 5001 000 mg/L 的含氯消毒剂擦拭或者喷洒至外表潮湿进展消毒，消毒15 min 。一涂片及培育1. 一般细菌、真菌涂片及培育的BALF 标本：无菌容器，标本 1 ml ， 室温保存 2 h，超过 2 h，4 保存 24 h。如转运时间 2 h，宜使用转运培育基或在冷藏条件下转运。2. 对四周环境或对低温敏感的细菌 如流感嗜血杆菌和肺炎链球菌等的标本：采集后不宜冷藏，应马上送检。3. 如疑心厌氧菌感染，可以考虑床旁采

24、样。如不能床旁采样可常温下转运，宜在采集后 30 min 内送至试验室，转运过程中标本尽可能与空气隔绝。4. 病毒培育：室温保存 2 h，4 保存 5 d。超过 5 d，需-70 保存。5. 寄生虫：镜检虫卵，颖标本4 保存 1 h。二抗原抗体检验1. 病毒快速抗原及直接荧光抗体检验：室温保存2 h，4 保存 5 d。超过 5 d，需-70 保存。2. 真菌 1-3 -D- 葡聚糖 G 试验：室温保存 2 h，4 保存5 d。超过 5 d，需-70 保存。3. 曲霉半乳甘露聚糖抗原galactomannan ，GM 检测：室温保存 4 h，4 保存 24 h。超过 24 h，宜在 -20 条件

25、下，可存放11 个月。4. 组织胞浆菌抗原室温保存2 h，4 保存 72 h 。5. 皮炎芽生菌抗原4 保存 214 d 。6. 肺孢子菌直接荧光抗体检测室温保存2 h，4 保存 7 d。三分子诊断 如核酸扩增检测、聚合酶链反响技术、宏基因组一代测序技术 metagenomicsnext-generationsequencing ， mNGS 等1. 标本采集：无需任何预处理、颖合格的BALF 收集于枯燥无菌、无 DNA/RNA 酶的冻存管中，送检量不少于3 ml 。2. 标本保存：细菌真菌等分子诊断检测，假设不能准时进展冻存，4 保存 24 h 。如进展核糖核苷酸 RNA 建库测序，样本需在

26、 -70 以下保存，且不应超过6 个月；如进展脱氧核糖核苷酸DNA 建库测序，样本在 -20 保存 1 周， -70 以下可长期保存。病毒核酸检验，室温保存 30 min ，4 保存 4 h，超过 4 h 需-70 保存。3. 标本转运：宜在 -70 或更低温度下转运。标本需承受干冰干冰温度为 -78.5 在医用冷藏加厚泡沫箱里进展密封运输，且需保证标本在送至检测单位时仍有干冰掩盖防止优势菌群的生长或者RNA 病毒的降解。在运送过程中宜保存在适当的病毒转运液或其他相应的缓冲液中。4. 储存样本必需避开反复冻融。四 BALF 细胞计数和分类、 T 淋巴细胞亚群、细胞学检测室温保存 30 min

27、。假设标本在 3060 min 后到达试验室，建议 4 冰上保存运输。假设标本超过60 min 后到达试验室，建议先250300 g离心 10 min保持细胞完整性，然后悬浮于养分液， 4 保存 24 h 。BALF 标本不应冷冻或干冰运输。超过24 h 的标本不再适合细胞计数及分类。七、BALF 分类计数一送检的量用无菌容器收集 BALF 标本，送检量为 1020 ml 至少 5 ml ，贴好标本信息。二操作流程1. 标本送至试验室后，需马上处理。先观看灌洗液的性状、颜色和总量，并记录。假设含有黏液成分的标本， 可用无菌纱布过滤或使用0.1% 的二硫苏糖醇进展溶解，并记录处理后的总量。2.

28、将上述回收灌洗液在4 下，以 250300 g 离心 10 min ，细胞沉淀重悬于 35 ml 细胞培育基，如MEM 125 mmol/L HEPES 或RPMI1640 125 mmol/L HEPES ，制成细胞悬液也可用生理盐水或不含 Ca2+离子和 Mg2+离子的 Hank s 液重悬。上清液在 -70 储存，用做可溶性成分的检测。3. 在计数板上计数 BALF 中细胞总数，一般以 1106/ml 表示。假设细胞数过高时，再用细胞重悬液稀释，调整细胞数为 5106/ml ，并同时将试管浸入碎冰块中备用。4. 承受细胞离心涂片装置， 参加备用细胞悬液 细胞浓度为 5 106/ml 10

29、0 l，在 4 下以 250300 g 离心 10 min ，通过离心作用将肯定数量的BALF 细胞直接平铺于载玻片上。取下载玻片马上冷风吹干， 一般用瑞氏- 姬姆萨复合染色法 Wright-Giemsastaining 或苏木精 -伊红染色法hematoxylin-eosin staining，HE 染色。5. 先在低倍光学显微镜40 倍下观看整张片子的状况，然后在高倍光学显微镜下 40 倍计数至少 400 个细胞，进展细胞分类计数。支气管灌洗液中常见细胞形态见图6。图 6 常见支气管灌洗液中各类细胞的形态HE高倍放大。图AG 分别为肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞、不合格标本

30、、尘细胞、肺泡蛋白沉积症患者灌洗液三留意事项1. 标本采集后，需马上送检。室温1 h 内送至试验室，如超1 h，需250300 g 离心 10 min 后，在细胞培育基中重悬浮， 并在 4 下保存，可保存 24 h。如没有离心机，可将细胞培育基直接添加到灌洗样本中，在 4 下可保存 12 h 。标本不能冻存。2. 第 1 管回吸取液不建议做常规细胞学分析。八、BALF 的微生物检验一显微镜检查1革兰染色：用于区分革兰阳性和阴性细菌，阳性菌染色为蓝紫色，阴性细菌染色 为红色。同时观看白细胞状况，假设见到吞噬菌现象，须报告吞噬细 菌的种类及吞噬细菌的中性粒细胞占或全部中性粒细胞的比例。2. 抗酸染

31、色和弱抗酸染色：用于检测分枝杆菌，弱抗酸染色主要用于检测奴卡菌。两者染色均为 红色，背景及非抗酸菌染为蓝色。3. 荧光染色：利用荧光染料及荧光标记抗体特异性结合不同种类病原体的特性来检 测病原微生物，如真菌、军团菌、肺孢子菌及呼吸道感染病毒，特异 度强、敏感度高。4. 瑞氏染色：细菌染成蓝色，组织细胞的细胞质呈红色，细胞核呈蓝色，嗜酸颗粒 染成橘红色。5. 六胺银染色：常用于肺孢子菌的检测， 也可用于隐球菌， 念珠菌和丝状真菌的检测。真菌孢子和菌丝被染成黑褐色。6. 墨汁染色：主要用于隐球菌的检测。低倍镜下观看，黑色背景中可见隐球菌宽厚 透亮的荚膜。7. 异染颗粒染色：用于白喉棒状杆菌染色，异

32、染颗粒可明显地被显示出来。8. 芽孢染色石碳酸复红染色：芽孢呈红色，菌体呈蓝色。二培育 1一般培育：涡旋震荡 BALF 标本 1 min ，BALF 标本1 5001 800 g 离心 1520 min 。细菌培育接种于血平板及麦康凯或中国蓝平板，置一般培养箱 3537 培育，巧克力平板，置于5% CO2 培育箱 3537 培育。真菌培育接种于沙保弱培育基或显色培育基于25 培育。一般细菌培育至少2 d，念珠菌培育 5 d，对于慢生长细菌及双相真菌或局部丝状真菌需适当延长培育时间。2. 结核分枝杆菌培育：灌洗液 3 000 g离心 15 min ，灌洗液离心后取适量沉渣， 参加溴化麝香草酚蓝指

33、示剂 bromthymolblue indicator ，BTB 12 滴，用2%4% 氢氧化钠中和， 接种于改进罗氏培育基， 或 BD 公司结核分枝杆菌液体培育基。置于3537 培育，第 1 周观看 2 次，以后每周1 次，直至 6 周，方可出阴性报告。阳性者观看菌落消灭时间与形态， 并进一步鉴定。3. 军团菌培育：灌洗液离心，经加热或酸处理后，接种于缓冲炭酵母提取物琼脂根底buffered charcoal yeast extract agar ，BCYE 培育基、血平板和巧克力平板，置于 5% CO 2 孵箱培育。假设 BCYE 培育基 24 h 内有细菌生长，此菌不是军团菌，假设 48 h 后生长，而血平板和巧克力平板不生长，此菌可能是军团菌，应进一步鉴定。三核酸检测及抗原检测