猫细小病毒PCR检测方法.docx

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1、猫细小病毒PCR检测方法猫细小病毒 Felinepanleukopeniavirus,FPLV 属细小 病毒科，细小病毒亚科，牛犬细小病毒属成员，又称猫泛白 细胞减少症病毒、猫传染性胃肠炎病毒或猫瘟病毒。1、试剂1. 1要求除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为符 合GB/T6682要求的灭菌双蒸水或超纯水。1. 2试剂1. 2. 1核糖核酸酶（20mg/mL）。1. 2. 210%十二烷基磺酸钠溶液。1. 2. 310mg/mL 蛋白酶 K。1. 2. 4Tris-盐酸饱和酚（pH7. 6） 01. 2. 5酚-氟仿-异戊醇混合液（25： 24： 1）;在一灭菌棕色 瓶中按25:24

2、： 1比例分别加入酚、氯仿、异戊醇。1. 2. 63mol/L 乙酸钠（pH5. 4）。1. 2. 7琼脂糖。1. 2. 810 u g/L 澳化乙锭（ethidiumbromide, EB）：澳化乙 锭20mg加灭菌双蒸水至20mL充分溶解混匀而成。1. 2. 950xTAE缓冲液:羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242g、 冰乙酸57. 1mL、0. 5mol/L乙二铁四乙酸二钠溶液（pH8. 0） 100mL,加灭菌双蒸水至1000mL充分混匀。1. 2. 10加样缓冲液：聚蔗糖25g澳酚蓝0. 1g、二甲苯青 01g,加灭菌双蒸水至100ml.充分溶解混匀而成。1.2. 112.5mmo

3、ldNTPs （deoxyribonucleosideriphosph ates,脱氧核糖核甘三磷酸）。1.2.1210*PCRBuffero1. 2. 13DNA 分子量标准：DL2000。1. 2. 14 引物序列 FPLV-F： 5-CCAGCTGAGGTTGGTTATAGTG- 3 FPLV-R：5 -GGTGCATTTACATGAAGTCTTGG3?。2、仪器设备2. 1高速冷冻离心机：要求最大离心力在12000*rpm以 上O2. 2PCR扩增仪。2. 3核酸电泳仪和水平电泳槽。2. 4微波炉。2. 5分析天平。2. 6恒温水浴锅。2 . 7冷藏冰箱和低温冷冻冰箱。3 .8微量移液

4、器。2. 9凝胶成像系统（或紫外透射仪）。2. 10高压灭菌锅。2. 11超净工作台或生物安全柜。3、操作步骤3. 1样品的采集和处理3. 1.1采集动物粪便、拭子、全血或肠道等组织样品并 进行处理：(a)肛拭子、粪便(加适量PBS)等样品经 45000rpm/niin 离心 2nlin,取上清液；(b)全血样品待血凝后经5000rpm/min离心2ndn,取血 清；(c)取01g肠道等样品与灭菌PBS(全称、浓度)按1:5的 重量体积比制成悬液，匀浆后，反复冻融3次，在涡旋混合 器上混匀后经45000rpm/min离心lOmin,取上清液。3. 1. 2制备的样品在2。(28。(2保存时间应

5、超过24h长期 保存应分装成小管，置于-2(rc以下，避免反复冻融。3. 2DNA的提取3.2. 1设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为猫细小病 毒阳性样品，阴性对照为灭菌双蒸水。3. 2. 2按下列步骤完成DNA的提取，也可选择市售商品 化DNA提取试剂盒，完成DNA的提取。(a)取15mL灭菌离心管，加入处理样品511上清液 400 uL和30 uL(20mg/niL)核糖核酸酶，混匀后，室温下作 用 20min；(b)加入43 uL10%的十二烷基磺酸钠溶液和5L蛋白酶 K, 42C水浴温育过夜(或5530min以上)；(c)加入等量的Tris-盐酸饱和酚，充分混匀， 12000rpm/m

6、in离心5min,小心吸出上层水相于新的1. 5mL 灭菌离心管中；(d)加等量的酚-氯仿-异戊醇(25:24： 1),充分混匀， 12000rpm/min离心5min,小心吸出上层水相至新的1. 5mL 灭菌离心管中；(e)加1/10体积3mol/L的乙酸钠(pH5. 4) , 2. 5倍体 积预冷的无水乙醇15000rpm/min离心20min,弃去乙醇， 75%的乙醇洗涤沉淀一次后真空干燥。用20uL灭菌双蒸水溶 解沉淀，-20盖好电泳仪，插好电极，5V/cm电压电泳， 30nlin45nlin (指示试剂跑至1/3处)3. 3结果观察用紫外凝胶成像仪或者紫外透射仪观察扩增结果。4、结果判定在阳性对照出现464bp的扩增带、阴性对照无目的条带 的条件下，待检样品出现464bp的扩增条带，则判定为样品 阳性，否则判定为阴性。