Modfit分析细胞周期指南.docx

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1、Modfit 分析细胞周期指南本指南只供给在 guava 流式细胞上使用细胞周期模块分析后产生的数据，其它请参阅产品使用说明书，本指南仅供参考。一概述细胞周期的概念：细胞由一次分裂完毕到下一次分裂完毕，都要经受一样的变化阶段 (即G1SG2M )周而复始地进展活动，细胞的这种生长、分裂循环即称为细胞周期 (cell cyc1e)。一个细胞周期包括有丝分裂期(M)和分裂间期(G1、S、G2)。尽管在各种细胞中各期所占时间都不尽一样，但相对而言M 期最短，S 期却较长。分裂间期：1 、G1 期 ，前一次有丝分裂完成到 S 期开头。各种与 DNA 复制有关的酶明显增多，线粒体、叶绿体、核糖体增多，质

2、网在更扩大，高尔基体、溶酶体都增加，中心粒彼此分别、复制。2、S 期：DNA、组蛋白合成3、G2 期， S 期完毕后到有丝分裂开头。由上可以看出 G2 期 、S 期、M 期反映了细胞的增殖活性，特别是 G2 期 、S 期因M 期较短。因而，G2/M+S反映了细胞增殖力量。二者有无差异要进展统计检验。细胞周期阻滞：对于生殖细胞及保持增殖力量的细胞(如干细胞)，由于细胞不断的增殖， 细胞总是处于从 G1 、S、G2 和 M 期的连续的细胞周期中。 在细胞周期的各阶段， 细胞分别进展着 DNA 复制、蛋白质合成及细胞分裂等重要的生理活动。每一阶段都是下一阶段的预备期, 真核细胞可以在启动下一个周期前

3、监测与一个细胞周期顺当完成相关的生化大事， 这包括各种体外因素威逼下游大事进展时可逆地将细胞周期阻滞在特定的生理阶段的力量， 而这种特定的生理阶段称为检定点(checkpoint) 。只有前一阶段的生理活动完成后，才能通过称为检定点的阶段，进入周期的下一步，一些突发大事引发的细胞反响能影响驱动细胞周 期前进的因子，从而使细胞周期停滞在检定点， 这被称为细胞周期阻滞(cell cycle arrest)。比较相应的细胞 G1 、S、G2 期差异有无统计学意义，才能说有无细胞周期阻滞。第一图：增值率S合成期G2/M合成后期/分裂期：21.7其次图：增值率S合成期G2/M合成后期/分裂期：19.6据

4、此分析两者的增值没有明显的差异。虽然其次图比第一图的S 期有所增高，但 G2 期下降了。细胞周期是基于细胞处于不同分裂时期具有不同的 DNA 含量而分析细胞处于不同的时期的方法。精准的说结果中 G1 期的百分比实际上是 G1G0 期细胞的百分比。 G2 的百分比实际上是 G2M 期细胞的百分比。二细胞样品制备在样品的制备中存在的问题主要是细胞的聚拢和碎片，虽然细胞通透剂种类很多，但用于碘 化丙啶PI染色进展细胞周期和倍体分析的细胞通透剂，通常为70冷乙醇；乙醇必需与细胞充分快速混匀，避开细胞聚拢成团；乙醇必需与细胞充分快速混匀，避开细胞聚拢成团； 流式细胞仪猎取细胞的速度不宜太快，在guava

5、 上要使用最低速。1. 用户首先使用 guava 的细胞周期试剂盒，并按相应的操作步骤进展细胞固定、染色后， 使用 guava 的细胞周期模块进展数据采集和分析，并生成以.ccy.CCY.FCS为后缀的文件。2. 细胞周期结果受样品制备的影响较大，请参阅相关文献进展样品制备。3. guava 细胞周期试剂盒简要操作步骤：1) 制备 70%的冰乙醇, -20C 预冷 2 小时2) 制备单细胞悬液,收集细胞,离心去除培液,用 PBS 重悬3) 离心,去除 PBS. 参加 100ulPBS 重悬.4) 将 100ulPBS 逐滴参加 7ml70%的冰乙醇中固定过夜5) 固定后,450g 离心 5 分

6、钟,弃固定液,用 3mLPBS 重悬.6) 再次离心, 弃 PBS,留细胞在离心管底部, 参加 500ul Cell Cycle 试剂7) 染色 30 分钟后上机检测.4. 请留意在固定步骤中，参加2070%酒精1 到 2ml打匀，固定，至少半个小时以上约 100ul 细胞用枪一滴一滴参加到 7ml 装有预冷 70%冰乙醇-20 至少 2 小时中，每加一次都需要反复吹打，以避开细胞成团；需要留意的就是加酒精固定的时候要用4预冷的酒精，缓慢的加，边加边晃动细胞，避开细胞黏连在一起。，不做的话，可放入 4冰箱保存 2-3 周问题不大。另在用预冷 PBS 洗去固定剂时，不宜洗得过多，以免细胞损失。三

7、Modfit 操作指南1. 双击 Modfit 图标，翻开 Modfit 软件无需安装，翻开界面如下：不用理睬弹出的信息，点击 OK 连续，会消灭下述界面，每个均点击OK 即可：2. 点击 File，在弹出的对话框中选中要分析的细胞周期文件FCS3.0 文件，点击 open 以翻开文件：3. 翻开文件，可以看到该文件包含10 个数据文件，假设分析第一个文件，则选中第一个文件如要在分析完第一个文件再分析其次个文件，需要关闭软件后，再次翻开软件，重复上述过程，再在翻开文件后消灭的 10 个数据文件中再选中其次个进展分析，其它8 个数据文件分析方法同上，点击 OK 以翻开该数据文件：4. 在选择参数

8、Choose parameter for analysis时选择第五个FL2-P-PM2Max：5. 选择右下脚的 Convert 按钮，在下述界面的 Linear-to-Log Conversion 下选择第六个FL2-W-PM2Width，点选 Convert to log 前的方框，再选中 OK 连续：6. 软件会回到前一界面，点击 OK 连续：7. 在下述界面中点选 Enable Gate 1，并选中 Define Gate 1 按钮进展设门：8. 在下述界面中左侧X Parameter选第六个参数FL2-W-PM2Width，右侧Y Parameter选择第五个参数FL2-P-PM2

9、Max，点击 OK 连续：9. 选中图中的黑色方框，当消灭+字形调整其位置，正常的细胞周期细胞应为上下两群细胞的哑铃外形，并调整方框的大小，以去除碎片及粘连细胞：10. 调整完成后，点击 OK 按钮，软件会回到设门的界面，点击OK 连续：11. 软件会消灭设门的细胞及细胞周期的峰图：12. 选择 Analysis 下的 Sync Wizard 中的第一个 Create or edit model:13. 软件消灭下述细胞周期的设置界面，分别进展G0/G1、G2/M 和 S Phase 的设置，调整时可选择其中的红色三角转变 G0/G1、G2/M 的位置，一般选择默认即可如不想设置，可直接选择其

10、次排的 Auto 按钮进展自动分析：14. 设置完成后，点击 Analysis 即可自动完成分析过程，并消灭分析结果如下，左侧为拟合的细胞周期图，右为统计数据：15. 选择 Edit 下的 Copy 按钮，即可将分析结果和图形复制到Word 文档或 PPT 文档中：16. 以下图为复制到 Word 文档后的状况：请留意，本指南不排解其编写容可能有不准确甚至错误的地方，仅供各位在做细胞周期时参 考。具体产品使用方法及留意事项，请参阅具体的产品使用说明书以获更具体的使用方法。指南的编写得到医科大学的玉芳教师的大力帮助，在此深表感。默克密理博生物科学部市浦东江高科技园区晨晖路88号二号楼2楼 ：202303：2 ：8市区曙光西里甲5号院凤凰置地广场A座写字楼18层 ：100028：0 ：0市黄埔大道西638号富力科讯大厦803A室 ：510627：8 ：2市芷泉街229号广场C座11楼7号 ：610061：0 ：3