PCR技术基本原理及相关知识.docx

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1、PCR 技术的根本原理 类似于 DNA 的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延长三个根本反响步骤构成：模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至 93左右确定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作预备；模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延长：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反响原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条

2、的与模板 DNA 链互补的半保存复制链重复循环变性-退火-延长三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，而且这种链又可成为下次循环的 模板。每完成一个循环需 24 分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR 的反响动力学 PCR 的三个反响步骤反复进展，使 DNA 扩增量呈指数上升。反响最终的DNA 扩增量可用 Y(1X)n 计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示平(Y)均每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反响中平均效率达不到理论值。反响初期，靶序列 DNA 片

3、段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的渐渐积存，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即消灭“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数状况下，平台期的到来是不行避开的。PCR 反响体系的根本成分：模板 DNA、特异性引物、DNA 聚合酶、dNTP、 Mg2+的缓冲液。PCR 反响体系与反响条件标准的 PCR 反响体系：10扩增缓冲液10ul4 种 dNTP 混合物各 200umol/L引物各 10100pmol模板 DNA0.12ugTaq DNA 聚合酶2.5uMg2+1.5mmol

4、/L加双或三蒸水至100ulPCR 反响五要素： 参与 PCR 反响的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是 PCR 特异性反响的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物， 利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右。引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易

5、消灭非特异条带。ATGC 最好随机分布，避开 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避开引物内部消灭二级构造，避开两条引物间互补，特别是3”端的互补，否则会形成引物二聚 体，产生非特异的扩增条带。引物 3”端的碱基，特别是最末及倒数其次个碱基，应严格要求配对，以避开因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。引物中有或能加上适宜的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度 0.11umol 或 10100pmol，以最低引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非

6、特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的时机。酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供给， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的自然酶， 另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反响约需酶量 2。5U(指总反响体积为100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量削减。dNTP 的质量与浓度 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有亲热关系，dNTP 粉呈颗粒状， 如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调整到 7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。屡

7、次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反响中，dNTP 应为 50200umol/L，尤其是留意 4 种 dNTP 的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的DNA 纯化方法通常承受 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白

8、酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR 反响。一般临床检测标本，可承受快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR 扩增。RNA 模板提取一般承受异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。Mg2+浓度 Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反响中，各种dNTP 浓度为 200umol/L 时，Mg2+浓度为 1.52.0mmol/L 为宜。Mg2+浓度过高，反响特异性降低，消灭非

9、特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反响产物削减。PCR 反响条件的选择PCR 反响条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延长三个温度点。在标准反响中承受三温度点法，双链DNA 在 9095变性，再快速冷却至 40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延长。对于较短靶基因(长度为 100300bp 时)可承受二温度点法， 除变性温度外、退火与延长温度可合二为一，一般承受 94变性，65左右退火与延长(此温度 Taq DNA 酶仍有较高的催化活性)。变性

10、温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要缘由。一般状况下， 9394lmin 足以使模板 DNA 变性，假设低于 93则需延长时间，但温度不能过高，由于高温环境对酶的活性有影响。此步假设不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失败。退火(复性)温度与时间：退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至 4060，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物简洁得多，引物和模板之间的碰撞结合时机远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸，G+C 含量约

11、50%的引物，55 为选择最适退火温度的起点较为抱负。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择适宜的温度：Tm 值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm 值-(510)在 Tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大削减引物和模板间的非特异性结合， 提高 PCR 反响的特异性。复性时间一般为 3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延长温度与时间：Taq DNA 聚合酶的生物学活性：7080 150 核苷酸/S/酶分子70 60 核苷酸/S/酶分子55 24 核苷酸/S/酶分子高于 90时， DNA 合成几乎不能进展。PCR 反响的延长温度一般选择在 7075之间，常用温度为

12、 72，过高的延长温度不利于引物和模板的结合。PCR 延长反响的时间，可依据待扩增片段的长度而定，一般 1Kb 以内的 DNA 片段，延长时间 1min 是足够 的。34kb 的靶序列需 34min；扩增 10Kb 需延长至 15min。延进步间过长会导致非特异性扩增带的消灭。对低浓度模板的扩增，延长时间要稍长些。循环次数 循环次数打算 PCR 扩增程度。PCR 循环次数主要取决于模板 DNA 的浓度。一般的循环次数选在 3040 次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。PCR 产物的电泳检测时间一般为 48h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48h 后带型不规章甚致消逝。假阴性

13、，不消灭扩增条带PCR 反响的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR 循环条件。查找缘由亦应针对上述环节进展分析争论。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq 酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丧失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不消灭扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜任凭更改。酶失活：需更换酶，或旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需留意的是有时忘加 Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物

14、的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不 抱负、简洁弥散的常见缘由。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看OD 值，更要留意引物原液做琼脂糖凝胶电泳，确定要有引物条带消灭，而且两引物带的亮度应大体全都，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止屡次冻融或长期放冰箱冷藏局部，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体

15、等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。反响体积的转变：通常进展 PCR 扩增承受的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul，应用多 大体积进展 PCR 扩增，是依据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，确定要模索条件，否则简洁失败。物理缘由：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能消灭假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PC

16、R 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延长温度，这也是PCR 失败的缘由之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。假阳性消灭的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带全都，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不适宜：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进展 PCR 扩增时，扩增出的PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，简洁消灭假阳性。需重设计引物。靶序列或扩增产物的穿插污染：这种污染有两种缘由：一是整个基因组或大片段的穿插污染，导致假

17、阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应留神轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，全部试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反响管和试剂用紫外线照耀，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染， 这些小片段比靶序列短，但有确定的同源性。可相互拼接，与引物互补后，可扩增出PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消退。消灭非特异性扩增带PCR 扩增后消灭的条带与估量的大小不全都，或大或小，或者同时消灭特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的消灭，其缘由：一是引物与靶序列不完全互补、 或引

18、物聚合形成二聚体。二是 Mg2+ 离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易消灭非特异条带而另一来源的酶 则不消灭，酶量过多有时也会消灭非特异性扩增。其对策有：必要时重设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，削减循环次 数。适当提高退火温度或承受二温度点法(93变性，65左右退火与延长)。消灭片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时消灭涂抹带或片状带或地毯样带。其缘由往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：削减酶量，或调换另一来源的酶。削减 dNTP

19、 的浓度。适当降低 Mg2+浓 度。增加模板量，削减循环次数。逆转录-聚合酶链反响 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA 作为模板,承受Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA. 再以 cDNA 为模板进展 PCR 扩增,而获得目的基因或检测基因表达.RT-PCR 使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能.该技术主要用于:分析基因的转录产物,猎取目的基因, 合成 cDNA 探针,构建 RNA 高效转录系统.Tr

20、izol 法 RNA 提取步骤标记EP 管，分 3 组第一组EP 管参与氯仿 0.2ml，二组参与异丙醇 0.5ml，三组参与 75%乙醇 1ml 1ml Trizol、心或肺 50100mg、液氮依次参与到研钵中，研碎收集组织液 1.5ml 至 EP 管，离心：15000rmp、4、15min取上清，转移至氯仿组，摇摆 15s，冰上放置 10min离心：15000rmp、4、15min取上清，转移到异丙醇组的EP 中，冰上放置 20min离心：15000rmp、4、15min弃上清，加 75%乙醇 1ml0.1%DEPC 水配制 离心：15000rmp、4、5min弃上清，枯燥 15min，

21、加 100ul DEPC 处理的水RT-PCR 引物的选择随机引物适用于长的或具有发卡构造的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等全部 RNA 的反转录反响。主要用于单一模板的 RT-PCR 反响。Oligo dT适用于具有PolyA 尾巴的RNA。原核生物的 RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和tRNA不具有 PolyA 尾巴。由于 Oligo dT 要结合到 PolyA 尾巴上，所以对RNA 样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长 cDNA 合成量大大削减。基因特异性引物 与模板序列互补的引物，适用于目的序列的状况。天为时 性引物 代公司的SuperScrip

22、t One-Step System 特别适合于与基因特异性 引物连用。PCR 扩增后消灭的条带与估量的大小不全都，或大或小，或者同时消灭特异性扩增带与非特异性扩增带。引物Mg2+浓度耐热聚合酶退火温度缘由引物特异性差引物浓度过高Mg2+浓度过高酶量过多退火温度过低建议重设计引物，转变引物的位置和长度，增加其特异性或使用巢式 PCR适当削减引物浓度适当降低 Mg2+浓度，从 1mM 到 3mM，间隔 0.5mM 进展一系列反响，确定对于每个模板和引物对的最正确镁离子浓度。以 0.5U 为间隔适当削减酶量适当提高退火温度或承受二阶段温度法PCR 循环次数PCR 循环次数过多削减 PCR 循环次数4

23、. 操作多份样品时，制备反响混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以削减操作，避开污染，又可以增加反响的准确度；5. 最终参与反响模板，参与后盖紧反响管电泳法定义：是指带电荷的供试品蛋白质、核苷酸等在惰性支持介质如纸、醋酸纤维素、琼脂糖 凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进展泳动， 使组分分别成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。电泳技术的根本原理和分类在电场中，推动带电质点运动的力F等于质点所带净电荷量Q与电场强度E的乘积。FQE 质点的前移同样要受到阻力F的影响，对于一个球形质点，听从 Sto

24、ke 定律，即： F6r式中 r 为质点半径，为介质粘度，为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：FF即 QE6r可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度 成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。电泳法可分为自由电泳无支持体及区带电泳有支持体两大类。前者包括 Tise-leas 式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳常压及高压、薄层电泳薄膜及薄板、凝胶电泳琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶 等。自由电泳法的进展并不快速，由于其电泳仪构造简洁、体积浩大，操作要求严格，价格昂

25、贵 等。而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。本节仅对常用的几种区带电泳 分别加以表达。影响电泳迁移率的因素电场强度电场强度是指单位长度cm的电位降，也称电势梯度。如以滤纸作支持物， 其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为 20cm，测得的电位降为 200V，那么电场强度为 200V/20cm10V/cm。当电压在 500V 以下，电场强度在 2-10v/cm 时为常压电泳。电压在 500V 以上，电场强度在 20-200V/cm 时为高压电泳。电场强度大，带电质点的迁移率加速， 因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。2溶液的 pH 值溶液的pH 打算

26、被分别物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。例如蛋白质分子，它是既有酸性基团-COOH，又有碱性基团-NH 的两性电解质， 在某一溶液中所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，蛋白质在电场中不再移动，溶液的这一 pH 值为该蛋白质的等电点isoelctric point，pI。假设溶液 pH 处于等电点酸侧，即 p Hpl，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。假设溶液 pH 处于等电点碱侧，即 pHpl，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的 pH 离 pl 越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应依据样品性质，选择适宜的 pH 值缓冲液。溶液的离子强度 电泳液

27、中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。其缘由是带电质点吸引相反符合的离子聚拢其四周，形成一个与运动质点符合相反的离子氛ionic atmospher e，离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。然而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的 pH 值，影响质点的带电量，转变泳动速度。离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关。可用离子强度 I 表示。电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗electro-osmosis。其产生的缘由是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使 溶液相对带负电或正电。如

28、以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附 OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生 H3O+，带正电荷移向负极，假设质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，假设质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以削减电渗的影响。电泳分析常用方法二凝胶电泳以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。 其中聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis，普遍用于分别蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分别同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较

29、广，介绍如下：琼脂糖凝胶电泳的原理概述琼脂糖是由琼脂分别制备的链状多糖。其构造单元是 D- 半乳糖和 3.6-脱水-L-半乳糖。很多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其相互盘绕形成绳状琼脂 糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分别、鉴定及纯化。 在临床生化检验中常用于 LDH、CK 等同工酶的检测。琼脂糖凝胶电泳分别核酸的根本技术在确定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA 分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环 DNA直线DNA开环双链 DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状 DNA球形不能进入胶中， 相对迁移率为 0，而同等

30、大小的直线 DNA刚性棒状可以按长轴方向前移，相对迁移率大于 0。设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝 胶，而且制胶与加样都比较便利，故应用比较广泛。核酸分别一般用连续缓冲体系，常用的有T BE0.08mol/L TrisHCl，pH8.5，0.08mol/L 硼酸，0.0024mol/L EDTA和 THE0.04mol/L TrisHCl。pH7.8，0.2mol/L 醋酸钠，0.0018mol/L EDTA。凝胶制备：用上述缓冲液配制 0.5-0.8琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之溶化，冷至55时参与溴化乙锭EB至终浓度为 0.5g/ml，

31、然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板 0.5-1.0mm，待脱凝固后， 取出梳子，参与适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下 1mm 处。样品制备与加样：溶解于 TBE 或THE 内的样品应含指示染料0.025溴酚蓝或桔黄橙、蔗糖10-15或甘油5-10，也可使用2.5Fico 增加比重，使样品集中，每齿孔可加样 5-10g。电泳：一般电压为 5-15V/cm。对大分子的分别可用电压 5V/cm。电泳过程最好在低温条件下进展。样品回收：电泳完毕后在紫外灯下观看样品的分别状况，对需要的 DNA 分子或特别片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进展回收

32、，如电泳洗脱法：在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶， 将其装入透析袋内含适量颖电泳缓冲液，扎紧透析袋后，平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中，100V 电泳 2-3 小时，然后正负电极交换，反向电泳 2 分钟，使透析袋上的 D NA 释放出来。吸出含 DNA 的溶液，进展酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收。废弃溴化乙锭 EB 净化和处理方法1 严禁任凭丢弃。由于 EB 是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害很大。2 废 EB 溶液的处理方法(1) 对于 EB 含量大于 0.5mg/ml 的溶液，可如下处理：a. 将 EB 溶液用水稀释至浓度低于 0.5mg/ml；b. 参与一倍体积

33、的 0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再参与等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时；c. 参与一倍体积的 2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。(2) EB 含量小于 0.5mg/ml 的溶液可如下处理：a. 按 1mg/ml 的量参与活性炭，不时轻摇混匀，室温放置 1 小时；b. 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。3 废 EB 接触物，如抹布，枪头。一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期进展燃烧处理。PCR 扩增产物的电泳分析凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种.一、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳是一种格外简便、快速、最常用的分别纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提

34、取的一种线状高聚物.依据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖. 低熔点琼脂糖熔点为 6265，溶解后在 37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA 片段的回收，质粒与外源性 DNA 的快速连 接等.(一)凝胶浓度琼脂糖浓度(%)线型 DNA 分子的分别范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12凝胶浓度的选择依 DNA 分子的大小而定. 琼脂糖凝胶的浓度与 DNA 分别范围(二)电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和 Tris-磷酸(TPE).TBE 与 T P

35、E 缓冲容量高，DNA 分别效果好，但TPE 在 DNA 片段回收时含磷酸盐浓度高，简洁使 DNA 沉淀. TAE 缓冲容量低，但价格较廉价，因而推举选用 TBE.缓冲液中的 EDTA 可螯合 二价阳离子，从而抑制 DNA 酶的活性，防止 PCR 扩增产物降解.10XTBE 缓冲液的配制Tris 硷，108 克EDTA，9.3 克硼酸，55 克H2O 至，1000ul(其 PH 应为 8.08.2)临用时用水稀至 0.5XTBE(20 倍稀释. (三)核酸电泳的指示剂与染色剂1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在 0.6%、1%、1.4%和

36、 2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与 1Kb、 0.6Kb、0.2Kb 和 0.15Kb 的双链线性 DNA 片段大致一样.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和 1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与 2Kb 和 1.6Kb 的双链线性 DNA 大致相像.指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400 组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有增加样 品密度，使其比重增加，以确保 DNA 均匀沉入加样孔内.在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可推想核酸电泳的速度和位置.使样品呈色，使加样操作更便利.染色剂:核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其 次是银染色.溴化乙锭(ethi

37、dium bromide，EB)是一种荧光染料，EB 分子可嵌入核酸双链的碱基对 之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.依据状况可在凝胶电泳液中参与终浓度为 0.5ug/ml 的 EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色 1015min.琼脂 糖凝胶 EB 染色，肉眼可见核酸电泳带，其 DNA 量一般5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡 30min 后再观看.银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用复原剂如甲醛 使 Ag+复原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶

38、染色.其灵敏度比 EB 高 200 倍.但银染色后，DNA 不宜回收.(四)电泳1.电泳装置:电泳装置主要有电泳仪，电泳槽及灌胶模具等. 2.电泳方法:(1) 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上，并架好梳子.(2) 依据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般 200400bp 的 DNA 片段， 可配制 1.21.7%浓度的琼脂糖用于电泳.3. 配制 0.5XTBE 电泳缓冲液 100ml 于三角烧瓶中，称取确定量的琼脂糖粉放入后沸水锅 或微波炉内加热熔化.冷却至 60(需要时可参与溴乙锭)，倒入电泳槽中，待凝固.4. 向电泳槽中倒入 0.5XTBE，其量以没过胶面 2mm

39、 为宜，留神移去梳子.如样品孔内有 气泡， 应设法除去.5. 在 DNA 样品中参与 0.2 体积的载样缓冲液，混匀后，参与样品孔内.6. 接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记 DNA 样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负).电压为 1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算).7. 依据指示剂泳动的位置，推断是否终止电泳.一般 200400bp 的 PCR 产物 50V 电压， 电泳 2040min 即可.(3) 溴化乙锭染色后，紫外仪上观看电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩 增产物的大小.IMD 行PCR 的条件： PCR was performed by the f

40、ollowing steps: 94 C for 1 min, then 32 cycles of 94 C for 30 s, 60C for 30 s,72 C for 1min, and finally 72 C for 7 min. The number of cy cles for TrAM-2 and -4 was increased to 35 because of the low signal。quantity one 软件，对于生疏分子生物学试验技术凝胶成像操作的各位大侠确定都不生疏，可是这个软件功能格外全面，对于每一个功能不知大家是不是一样的生疏，我目前正在使用它的一项功能

41、，稍稍了解了一点，期望能讲给大家，不到之处，还请各位教育！ 我想向大家介绍band analysis 功能：1. 首先翻开*.lsc 或*.tif 等格式的图像文件2. 用 image tool 工具中的crop 功能选取分析的条带区域3. 用 transform 功能转变图像的背景4. 选 frame lanes 功能，确定分析区域，一条带对应于选择的数字为15. 用 stretch lanes 及 add/adjust anchors 进展区域的调整，点击每个框架四周的4 个小圆圈待光标有变化时，即可拖动调整区域的范围6. 用 lane background substraction 功能进展本底剪影7. 用 detect band 功能进展条带的标记，可以通过调整敏感度来使标记的条带认为受到把握，利于对一些结果准确和客观的判读，band 工具栏中有编辑，去除及调整band 的工具进展band 的修改8. 用 standards 功能，选择适宜的standards9. band attributes 功能了解band 信息描述10. all lanes report 给出关于每一条band 的分析结果，可以保存为*. txt 文件，常选的指标有峰值，域值，相对量等，条带分析即可完成