WB实验问题.docx

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1、共享学问共享欢快Western Blot 问题指南时间:2023-05-13 08:55来源:网络 作者:admin 点击:3679次依据问题的类型主要分成以下几类以下资料权作参考，请勿盲目仿照！; 1. 参考书推举 A. 对初学者看什么资料比较好？ 解答：抗体技术试验指南和 Antibodiesa laboratory manual，依据问题的类型主要分成以下几类以下资料权作参考，请勿盲目仿照！;1. 参考书推举A. 对初学者看什么资料比较好？解答：抗体技术试验指南和 Antibodiesa laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane两

2、本书不错。2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot 以下简写成Western Blot，提取线粒体后冻存未加蛋白酶抑制剂，用的博士德的一抗，开头还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120g，换了个santa cloz 的一抗仍不行。是什么缘由？蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗？解答：疑心是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot 过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加 PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。C. 同一蛋白样品能同时进展两种因子的Western Blo

3、t 检测吗？ 解答：固然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。D. 假设目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要留意什么？解答：假设是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温顺得多，这时最好加上NaF 去抑制磷酸化酶的活性。E 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时常常会觉察只有一局部蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶觉察有的孔全部的蛋白条带都在，只是颜色变淡了， 有什么方法可以解决？解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用削减电流延长时间，多加510甲醇。F. 想分别的蛋白是分子量260kd 的，SDS- 电泳的分别胶浓度多大适宜？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白

4、简洁作Western Blot 吗？解答：260kd 的蛋白不好做， 分别胶用6， Stacking Gel 3.5。G. 假设上样量超载，要用什么方法来增加上样量？假设需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答：可以浓缩样品，也可以依据你的目标分子量透析掉一局部小分子蛋白。一般地，页眉内容共享学问 共享欢快超载30是不会有问题的。假设已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm 的 comb。H. 蛋白变性后可以存放多久？解答：80，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。I. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理

5、说分别胶应当承受7.5%，但我所查资料却要求分别胶和浓缩胶均承受11的配方，不知为何？解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，由于105KD 的蛋白在上述两种胶的线性区分范围内，但需留意条带位置。J. 接下来我预备承受DAB 显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知承受这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5的脱脂奶粉呢？ 似乎有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？解答：不能使用脱脂奶粉，由于脱脂奶粉中含生物素，用BSA 代替应当好一点K. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？ 解答：Western Blot 一般上样30

6、100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开头摸条件时，为了拿到阳 性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，固然背景也就出来了。要拿到好的结果， 假设抗体好的话比较简洁，抗体不好的话就需要反复地试了，固然有的不适 合 Western Blot 的怎样做也不行。所以拿到好的结果不简洁。L. 做组织样品的western 的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA 好一点？解答：必需进展研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更 好，离心要充分，膜蛋白需用更猛烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽

7、提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要留意抑制蛋白酶的活 性参加PMSF 和蛋白酶抑制剂cocktail，封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。假设一抗为多克隆抗体，使用 BSA 也是不错的选择。M. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western 要留意什么呢？解答：做200kd 蛋白的Western Blot 时要留意，分别胶最好选择7%的；剥胶时要留神； 转移时间需要相应延长；要做分子量参照否则消灭杂带不知道如何分析。N. 有什么方法可以提高上样量？解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。O. 我要检测的目的蛋白是分子量或许为42kd 的膜蛋白，膜蛋白提取可

8、不行以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd 的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，而不是只需要提取膜蛋白，可以用 Ripa buffer 提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot 就可以了。假设是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以依据一般的转移方法实施。页眉内容共享学问共享欢快P. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？解答：上样量要依据试验的要求来定， 假设要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等， 假设只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超过0.3

9、 g/mm2。Q. 一抗，二抗的比例是否重要？解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉局部非特异的本底。3. 抗体R. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？ 解答：对二抗无要求，要看你试验条件来选择，一般推举用HRP 标记的二抗。S. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus 试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，假设封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最正确的抗体稀 释度也是不一样的，需要你试验摸索。我觉得转膜过夜似乎没有必

10、要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必铺张时间呢。至于具体的转膜时间，还要看 你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗固然可以过夜，假设你想所短 Western Blot 时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们试验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗 1：1500；二抗1：20230试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不简洁，多尽点心吧，这 样不会铺张你的时间，只会节约你的时间！T. 免疫组化和Western Blot 可以用同一种抗体吗？解答：免疫组化时抗体

11、识别的是未经变性处理的抗原打算簇 又称表位，有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，自然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间构造限制，煮后 变性会消逝。假设你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western，而假设抗体识别构象形 表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。限于单抗U. Western Blot 中抗体的重复应用问题解答：抗体工作溶液一般不主见储存反复使用，但是如抗体比较贵重，可反复使用23 次。稀释后应在23天内使用，4度保存，避开反复冻融。4. 滤纸

12、、胶和膜的问题V. NC 膜 PVDF 膜 尼龙膜怎样鉴别？解答：尼龙膜是较抱负的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最廉价；PVDF 膜介于二者之间。就结合力量而言：尼龙膜结合DNA 和 RNA 力量可达480600 g/cm2，可结合短至10bp 的核酸片段；硝酸纤维素膜结合 DNA 和 RNA 力量可达80100 g/cm2，对于200bp 的核酸片段结合力量不强；PVDF 膜结合 DNA 和RNA 力量可达125300 g/cm2。就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照页眉内容共享学问共享欢快射后，核酸中的局部嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸

13、纤维素膜依靠疏水性相互作用结合 DNA，结合不结实；PVDF 膜结合结实，耐高温，特别适合于蛋白印迹。就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易裂开；PVDF 膜较强。就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF 膜可以重复使用。W. 在做 Western Blot 时，PBDF 膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF 膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF 膜上面的正电基团，使它更简洁跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。X. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK 可以在同一张膜上吗？ 解答：可以。AA

14、. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端即点样空的一侧的转膜好象不是很好，为什么？解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。CC. 承受tank system 有什么讲究？解答：建议低电压，长时间，一般 tank System 用衡压好点，如 28V 1416hrs。 DD. 做 HSP WESTEN 定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN 却不能？解答：这多半是抗体的

15、问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot 和IHC。EE. 膜一般要如何处理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。FF. 假设是68转印膜，要加多少一抗？解答：一抗的稀释度是有说明的，依据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为35ml。GG. 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能到达最正确效果。解答：无要求。HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么缘由呢？是有的成分不对吗？解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿 保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。假设过夜，胶里的水分被蒸发，承受保鲜膜包上也可以；也可能母液30%聚丙酰胺有问题，你可以重配制 一份观看；

16、能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避开找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究？解答：假设是用的是半干转，挨次为：阴极滤纸胶膜滤纸。滤纸的长宽分别比胶小12mm，而膜的长宽分别比胶大12mm。确定禁忌：上下两层滤纸由于过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。页眉内容共享学问共享欢快JJ. 蛋白质的分子量跨度很大，如要分别小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd 和66kd 可以一起转，12SDS-， 湿转36V ， 35hrs 就可以了， 可以依据你试验室的阅历调整；170

17、kd 用7%SDS， 48V 10hrs16hrs。KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？解答：可以考虑：转移缓冲液中参加20%甲醇是指终浓 度(优化的转移缓冲液，可以参考蛋白质技术手册)，由于甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC 膜的结合力量，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇 对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液参加终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的 NC 膜0.2微米；使 用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压电流；增加转移时间。LL. 如何选择最适宜的蛋白杂交膜？解答：蛋白

18、质印迹杂交是分子生物学试验中极为常用的一门技术。选择质量上层、符合要求、便利适用的杂交膜是打算这项试验成败的重要环节。依据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。硝酸纤维素膜： 硝酸纤维素膜是蛋白印迹试验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一 起，虽然这其中的机制还不是格外清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。依据被转移的蛋白分子量大小，要选

19、择不同孔径的硝酸纤维素膜。由于随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越结实。但是 膜孔径假设小于0.1mm，蛋白的转移就很难进展了。因此，我们通常用0.45 m 和0.2 m 两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD 的蛋白就可以用 0.45 m 的膜，小于20kD 的蛋白就要用0.2 m 的膜了，假设用0.45 m 的膜就会发生“Blowthro gh”的现象。从膜的质地上来看，最 重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合力量主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维 素，因而降低了蛋白的结合量。S&S 公司承受的是100%纯度的

20、硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150 g/cm2。由于 100%的纯度，因而也大大削减了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜 比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。PVDF 转移膜：PVDF 是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF 膜可以结合蛋白质，而且可以分别小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，由于硝酸 纤维素膜在Edman 试剂中会降解，所以就查找了PDVF 作为替代品，虽然 PDVF 膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序抱负

21、的用品，始终沿用至今。PVDF 膜与硝酸纤维素膜一样，可以进 行各种染色和化学发页眉内容共享学问共享欢快光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF 膜，灵敏度、区分率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，格外适合于低分子量蛋白的检 测。但PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇进展浸泡饱和1-5秒钟。离子交换型转移膜： 硝酸纤维素和PVDF 膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是依据离子交换的方式结合生物大分子的。由 DEAE二乙氨乙基修饰的纤维素制成的 DEAE 阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE 可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下，DE

22、AE 基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的 pH 环境为5-7。DEAE 膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的争论。这种 0.45m 孔径的DEAE 膜，除了可以做Western Blotting 外，还可以用于核酸结合争论。还有一种离子交换型膜是羧甲基CM修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子， 以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH 范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM 膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。5. Marker 的相关疑问MM. 我用的是可视markerBIO_RAD，但是电泳总跑不全8条带，请问什么缘由？怎样改善？胶用过8，10，

23、12，都是这样。marker 是买的。解答：一般来说，是小分子量Marker 跑走了，增加胶浓度或削减电泳时间试试看。固然梯度胶也是不错的选择。NN. 用的是Roche molecular Biochemicals 公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd， 10kd 组成的marker。开头做 Western Blot 时还能够看到marker，固然也仅能观察其中最多三条带。用80V 进展SDS-电泳，用恒压10V45min 转印的。前几次做 Western Blot 时没有进展丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker 有一条大约是30KD 的条带消灭。再就是把7

24、0KD 和130KD 两个目的蛋白同时 在一块胶上进展分析，用培育基样品进展分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C 端的V5表位的酶联抗体Anti-V5-HRP。但就是出不来结果， 我很茫然。感谢您过赐予教导！解答：1、“我用的是 Roche molecular Biochemicals 公司的由100kd，75kd，45kd，30kd， 20kd，10kd 组成的 marker。开头做Western Blot 时还能够看到marker，固然也仅能观察其中最多三条带。”有的时候，Prestained Marker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清楚，集中。但是你的问题可能还有其他的方面的问

25、题，可能是蛋白跟膜结合的不严密。转移是多加点甲醇。2、“前几次做 Western Blot 时没有进展丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker 有一条大约是30KD 的条带消灭。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd 的转移地比较好。3、“再就是把70KD 和130KD 两个目的蛋白同时在一块胶上进展分析，用培育基样品进展分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白 C 端的V5表位 的酶联抗体Anti-V5-HRP。”是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性比照？你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs。页眉内容共享学问 共享欢快6. 染色的选择OO. We

26、stern Blot 哪种染色好？解答：1阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色 快，背景低检测极限可到达 1.5 g，考马虽然与氨基黑有一样的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S 和快绿在检测后简洁从蛋白质中除去，以便进展随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系 统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。（2） 胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg 级，但染色比稳定。（3） 生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。7. 参照的疑问PP. 是否Western Blot 试验半定量肯定要加ACTIN 内参？ 解答：对于发表文章的试验最好加内参，试验严谨。QQ. 用 B

27、ANDSCAN 分析结果行吗？ 解答：分析一般的结果没问题。RR. 核内抗原Western Blot 内参选择什么适宜？解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参， 在网上查查就可以选出你要的内参。SS. 转膜时承受电流是否比电压准确，是否依据0.8mA/cm2，一般1小时左右？解答：不是的， 半干法推举用恒流，一般依据目的蛋白的大小来确定电流和时间。TT. 做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot，内参B-actin，GAPDH，那个好？ 解答：选用beta-actin 就可以。8. 缓冲液配方的常见问题UU. 转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A

28、 是什么？还有Tris-HCl 是不是就是用Tris 和盐酸配出来的呢？解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的 TBST 脱脂奶粉。TrisHCl 就是 Tris 盐用 HCl调 ph 值，配置而成。VV. 预备做大鼠脑子的Western Blot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必需要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？解答：可以用提取总蛋白的buffer 提核蛋白，可以加NaF 防止去磷酸化。WW. 想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区分吗？解答：一般来说提取时参加光谱的蛋白酶抑制剂

29、就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特别的方法，一般来说都没有区分。XX. 最近作了两次Western Blot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB 显色液均试过，没问题。1、检测GAD-分子量67kd， 提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本-20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是 1:100。假设是一抗的缘由，不会背景都没有页眉内容共享学问共享欢快把？3、第一次有不均匀背景，由于一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱 脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA 的 TBS

30、T 液，TWEEN-20为0.1%，不会是封闭液的问题吧？解答：可以在下面几个问题上找找缘由。1. 封闭液用5Milk，漂洗液washing buffer用 TBST2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有问题。YY. 加甲醇的目的是什么？解答：加甲醇起着肯定的固定作用，由于小分子蛋白质简洁转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，由于NC 膜结合蛋白质的力量较弱)。ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的 TBST 脱脂奶粉”，其中 TBST 最终那个T 是 Tween吗，浓度多大？解答：是Tween，配方如下:Tris- Buffered Saline Tween-20 (

31、TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.AAA. 封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比方现在我就在室温里做，或者要在4度下?解答：均可在室温进展，假设时间不够，一抗孵育可以先在室温进展一个小时，然后4 度过夜。BBB. 试验室暂无NP40我用s

32、ds 可以吗？另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，颖参加：65mM DTT蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白主要是想得到其中的膜蛋白是否可行？改 良的 RIPA 裂解缓冲液(Tris.HCl， 50 mmol/L， pH 7.5; NaCl， 150 mmol/L; NP-40， 1%; 脱氧胆酸钠， 0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1 mmol/L; PMSF， 1 mmol/L

33、; Leupeptin，2 g/ml)不知对于膜蛋白效果如何？此外该方中的EDTA， 是否用做蛋白酶抑制剂？ 解答：做2-D 对不推举使用NP-40由于即使进口的 NP-40也不纯，其中的杂质会影响质谱结果。对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱相对于组织和大肠杆菌等，可以不使用 cocktail，由于7M 尿 素+2M 硫脲+4%CHAPS 构成的变性环境已经足以抑制大局部蛋白酶的活性，2M 硫脲+4%CHAPS 对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过假设您专职做膜 蛋白建议承受分级抽提法。此外还可以承受梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。EDTA 用于灭活金属蛋白酶主要是其鏊合作用。加过多的蛋白酶抑制剂可

34、以 导致蛋白质的修饰， 做 WB 无所谓，做MAILDI 时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质(在2-D 裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：供给 连续的 PH 梯度，从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一局部核酸)；也不推举承受SDS，因 SDS 会与蛋白质结合导致其等电点发生转变，假设您实 在要用，终浓度降到0.1%以下。METHOD2页眉内容共享学问共享欢快50ml 总量：?-mercaptoethanol 342 l；20% SDS 5 ml；Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加 ddH O 至 50 ml。2方法：将用过的膜浸入stripping bu

35、ffer 中，置50水浴箱中30min，连续振摇。之后用 TTBS 洗3*5min 就好。此时你已经可以按的转移好的膜来再次使用了。该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。METHOD31、beta-metaptoethanol 35 l 2、10%SDS 1ml3、tris (0.5M，pH6.7) 625 l4、dH O 3.34ml 50-55，30min。2METHOD4stripping buffer 应当是可以放置很久的。不过我习惯于现配到底，加了-mercaptoethanol 以后太难闻了，配了就用；而且，有了现成的 Tris-HCl 缓冲液和SDS的母液，现配还是很便利

36、的。每次用量5ml 少了点，我每次用50ml。METHOD50.5M NaCl，0.5M HAc；室温摇床15min。METHOD6将用过的膜泡在1*TBS 中室温振摇过夜，中间可以换液2-3次，然后封闭，加一抗，二抗同第一次发光，实践证明方法完全可行。不管用那种方法，洗脱后都要用PBS 或 TBS 再洗几次。9. 条件的摸索DDD. 用的是Santa Cruz 的抗体，也试验过一抗和二抗确定能结合，二抗加DAB 确定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker 对应的条带是否是我 要的我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD。半干法2小时转膜后，丽春红染色觉察大分子量蛋

37、白转过去的较少。莫非是裂解液出了问题？我用的是三 去污剂，但没加叠氮钠和或许叫Apoptin 的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解 -80度冻存的细胞，4度12023g 离心5分钟，取上清，与分子克隆其次版上的加样buffer 混合，沸水变性5分钟，上样。不知道是哪里出了问 题？解答：建议：1、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE 公司的BCA 试剂盒测蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应当在几-20微克/微升。2、假设是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD，建议分别用10和12的胶。60-80V，1小时左右。跑过积层胶与分别胶的线时，换用

38、100V，3-4小时。3、转膜，建议恒压，15V，不用转2小时，45分钟足以。您所说的大蛋白转过去的，并不是真正的少，而是由于在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过2小时，但和45分钟的区分并不大。4、依据 MARKER 的条带我的是7条带：14、18、25、35、45、66、116KD，您依据 MARKER页眉内容共享学问 共享欢快的条带剪下25与35之间29KD的条带，45-66之间50KD的条带。这样第一，可以节约抗体，其次，您要的目的条带确定在上面。5、延长1抗、2抗孵育时间我曾室温1小时，4度过夜，适当加大1抗浓度。6、我买的也是Santa Cruz 的抗体，我觉得质量还可以，我

39、想您应领先找其他方面的缘由。EEE. 电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反响体系下做出来了，固然彼此的目的蛋白不 同。所以，我想问题应当出在抗原和一抗上，不知对不对。解答：电泳的条件：样品的分子量打算了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下，电泳时溴酚蓝和10kd 左右蛋白跑在一起。由此可以打算电泳的电压和时间。建议你用恒压80100伏。FFF. BIO-RAD 的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温我用的就是这种，当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的状况下，就很简洁烧胶。就

40、 转膜时，是实行恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用恒流很简洁烧胶，我的胶有68cm2，用50mA 恒流来转膜，刚开头电压就很 高，有20 v 左右，而用恒压，开头电流有110mA，但15min 后，电流就降到8OmA，30min 后就稳定在40mA，不就相当于恒流吗？解答：恒流时电压渐渐上升的缘由是湿滤纸渐渐变干因而电阻渐渐增大的原因，假设电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以抑制。就我的感觉，20V 的电流30min 以后20Kd 以下的分子丧失很多，不过我用的是小胶40cm2，不知有无不同。GGG. 我想尽量提高转膜的效率我的试验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大

41、小蛋白不知道有那些方法？解答：不管怎么转都会存在蛋白转移不完全电压过小时间过短或过度转移电压过大时间过长的问题，鱼小分子量蛋白和熊掌大分子量蛋白不行得兼呵呵。建议把胶切成两半，比方以35KD 为界，分别进展转膜，下半时间短，上半时间长一点，应当会好一些。HHH. 请问一下PVDF 膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？解答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质 相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白简洁掉下来，结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合注： 常用的 PVDF 即带正电荷的尼龙膜，同时也有 疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF 膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。II

42、I. 1、煮好后的样品，假设没有准时上样分别，应如何保存，可以保存多久？2、有没有人在用bio-rad 的小型垂直电泳槽，有没有操作手册？3、湿式转移时是 否必需要用bio-rad 的专用滤纸？4、恒压转移的条件如何确定，由于我要分别小至21KD，中至66KD， 大致 170KD 的蛋白质，转移条件能够一样吗？5、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度？ 书上写不同的凝胶浓度分别的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是不 是不在这个范围内也能分别，只是就不是线性范围了？页眉内容共享学问共享欢快解答：1、煮好后的样品，放到-20，我们在一个月后此样品，效果一样。2、bio-rad 的小型垂直电泳槽的操

43、作手册在他们的主页Bio-Rad USA 上有。3、转移时一般的WATERMEN 滤纸就可以。4、转移条件是和蛋白质大小有关的：以次确定电压和时间。具体可让 ptglab 帮你定夺。5、凝胶的浓度也是和分别蛋白质大小有关。不是随心所欲选的，否则分别效果可能不是你所期望的。JJJ. 怎样设计试验来确定最正确的条件？解答：任凭说一点， 具体的还是需要自己想：1、在每个上样孔里上同样的蛋白样品，量也一样，最好是组织样，也可以跑1 个大well， 不插梳子，多上样，SDS-；2、转移， 设定电流或电压；3、每隔 1or n 小时，取一点膜染色，看转移效果。KKK. 我要测两种抗体，一种为磷酸化的目的蛋

44、白，一种为总的目的蛋白，不知道用什么方法 strip 最好，我用甘氨酸PH2.9漂洗15分钟，似乎没什么效果？解答：你可以加巯基乙醇loading buffer 一样的浓度，56度， 30mins，看看。 LLL. 1、在用 PBS 洗涤抗原-抗体-ProteinA-Agarose 复合物时，每次要重悬多长时间适宜？2、最终用2xSDS 重悬抗原-抗体复合物离心后， 由于2XSDS 中已经参加了溴芬兰， 因此下面的Agarose 珠子几乎看不到，所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了Agarose。不知有什么方法可以解决这个问题，或者即使吸进了一些Agarose 也不要紧呢？解答：1、不用重

45、悬多久，重悬起来了就可以离心了。2、加2X BUFFER 前大体上已经知道有多少胶粒了，吸到那个位置时留神点就是了。我也试过一些次，首先离心略微长一点，长20秒吧，期望胶粒能沉得结实点我想 象的，再吸取。假设感觉枪头不是很顺畅的时候可能就是遇到胶粒了。很难一点胶粒也吸取不上来的，尽力做好就是了。MMM. 磷酸化抗体的检测样本制备时是否肯定要加NaF 等？解答：NaF 是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大局部时候是不用加的。我做的时候从未加过，都做出来了。NNN. Western Blot 中 block 的最短时间?解答：每一步1小时足够了，中间换抗体要洗的话多换液几 次

46、，每次时间10分钟就够， 洗3次只要半小时。跑胶1小时，转移1小时，block 半小时就行，1抗1小时，洗半小时， 2抗1小时，洗半小时，显色10分 钟。一般跑两块胶，一块染色，一块western。一天确定完事，一般不用等到其次天。OOO. 想用Western 检测基因转染后细胞培育上清中表达的目的蛋白定性，分子量为 20KD，浓度约为几百ng/ml。蛋白样品需浓缩、纯化吗？如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白？对小分子蛋白Western blot 时需特别留意哪些条件？页眉内容共享学问共享欢快解答：依据你供给的浓度，假设做Western Blot，是不用浓缩样品的. 对于20kd 的小分子的蛋白

47、，Western Blot 中要留意的是：1、转移时的时间，2、转移时的电流或电压.3、transfer buffer 中加20%的甲醇. 4、可以用13-15%的分别胶.PPP. 蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较适宜？解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5 A/cm2， 30min 就应当够了。湿转，依据bio-rad 的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。QQQ. 需要测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量，但相互间干扰太大，怎么办？解答：将膜放入stripping bufferSDS 2%，TrisCl (PH=6.7) 62.5mM，beta-巯基乙醇 100mM中，50孵育30分钟，TTBS 西三次，再重参加一抗，进展另一种抗原的检测。RRR. 做 Western Blot试验时，觉察转膜时的电流总是偏小，转膜的效率也偏低. 100V 恒压转膜时的电流只有190mA 左右，而以前都有250mA。体系和条件都和以前一样，只是环境温度比以前低了很多。解答：有可能重复使用了转移缓冲液，随着离子的渐渐削减，电阻越来