PCR技术培训教材.docx

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1、PCR 技术培训教材PCR 培训教材PCR 根底理论一、半保存复制及转录、逆转录(1) DNA 的半保存复制(semiconservative replication)DNA 是全部原核生物和真核生物遗传的主要物质根底。在这些生物中遗传信息以遗传密码的形式编码在DNA 分子上，表现为特定的核苷酸排列挨次,并通过 DNA 复制(replication)由亲代传给子代。在DNA 合成进展时，以两条亲代DNA 链中的每一条链为模板，在DNA 指导下的DNA 聚合酶催化下，按A 与 T、G 与 C 碱基配对原则合成子代DNA 的过程称DNA 的复制。由于复制合成的子代DNA 两条脱氧核糖核苷酸链中有一

2、条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板合成的子代DNA 链，所以DNA 的这种合成作用又称半保存复制(图 1)。(2) RNA 的转录transcription过程以 DNA 为模板合成RNA 的过程称为转录transcription。转录是生物界RNA 合成的主要方式，是遗传信息由DNA 向RNA 传递过程，也是基因表达的开头。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依靠DNA 的RNA 聚合酶DNA-dependent RNA polynerase ,DDRP。转录产生初级转录物为RNA 前体RNA precursor，它们必需经过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。1PC

3、R 培训教材RNA 的转录合成从化学角度来讲类似于 DNA 的复制，多核苷酸链的合成都是以 53 的方向，在 3-OH 末端与参与的核苷酸磷酸二酯键，但是，由于复制和转录的目的不同， 转录又具有其特点：1对于一个基因组来说，转录只发生在一局部基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的把握；2转录是不对称的。3转录时不需要引物，而且RNA 链的合成是连续的。转录的主要过程分为识别与起始、延长和终止三个阶段。 (3)RNA 的逆转录reverse transcription过程 以 RNA 为模板，依据碱基配对原则，依据RNA 的核苷酸挨次(其中 U与 A 配对)合成 DNA。这一过程与一般遗传信息

4、流转录的方向相反，故称为逆转录，催化此过程的 DNA 聚合酶叫做逆转录酶(reverse transcriptase)。大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。DNA 聚合酶活性；以RNA 为模板，催化dNTP 聚合成 DNA 的过程。RNase H 活性；由反转录酶催化合成的cDNA 与模板 RNA 形成的杂交分子，将由RNase H 从 RNA5端水解掉RNA 分子。DNA 指导的DNA 聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA 单链为模板，以dNTP 为底物，再合成其次条DNA 分子。除此之外，有些反转录酶还有DNA 内切酶活性。反转录酶的觉察对于基因工程技术起了很大的推动作

5、用，目前它已成为一种重要的工具酶。二、PCR 技术的根本原理与PCR 技术的特点聚合酶链式反响(polymerase chain reaction,PCR),又称无细胞分子克隆系统或体外酶促基因扩增法。PCR 技术是由Kary B Mullis 于 1985 年联合制造的。该技术可将极微量的靶 DNA 特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA 分子的分析和检测力气，能检测单分子 DNA 或对每 10 万个细胞中仅含 1 个靶DNA 分子的样品。PCR 技术的根本原理其原理类似于 DNA 的自然复制过程，PCR 由变性退火延长三个根本反响步骤构成。模板DNA 的变性模板DNA 经加热至 93左右

6、一段时间后，模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响做预备；模板DNA 与引物的退火(复性)模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延长DNA 模板引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为反响原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条的与模板DNA 链互补的半保存复制链，重复循环变性退火延长三过程，就可获得更多的“半保存复制链,这种链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环需 24 分钟，23 个小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍。PCR 反响五

7、要素参与PCR 反响的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+。2PCR 培训教材PCR 反响条件PCR 反响条件为温度、时间和循环次数，温度、时间和循环次数的设置对PCR 的成功与否至关重要。1、温度与时间的设置基于PCR 原理三步骤而设置变性退火延长三个温度点。在标准反响中承受三温度点法，双链 DNA 在 9095变性，再快速冷却至 40 60，引物退火并结合到靶序列上， 然后快速升温至 7075，在TaqDNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延长。对于较短靶基因长度为 100300bp可承受二温度点法，除变性温度外，退火与延长温度可合二为一，一般承受 94变性，65左右退火与

8、延长此温度TaqDNA 酶仍有较高的催化活性。 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR 失败的最主要缘由。一般状况下，9394lmin 足以使模板DNA 变性，假设低于 93则需延长时间，但温度不能过高，由于高温环境对酶的活性有影响。此步假设不能使靶基因模板或PCR 产物完全变性， 就会导致PCR 失败。 退火复性温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至 4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物简洁得多，引物和模板之间的碰撞结合时机远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。

9、对于20 个核苷酸，G+C 含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为抱负。在Tm 值允许范围内，选择较高的复性温度可大大削减引物和模板间的非特异性结合，提高PCR 反响的特异性。复性时间一般为 3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。 延长温度与时间：PCR 反响的延长温度一般选择在 7075之间，常用温度为72，过高的延长温度不利于引物和模板的结合。PCR 延长反响的时间，可依据待扩增片段的长度而定，一般 1Kb 以内的 DNA 片段，延长时间 1min 是足够的。34kb 的靶序列需34min；扩增 10Kb 需延长至 15min。延进步间过长会导致非特异性扩增带的消灭。

10、对低浓度模板的扩增，延长时间要稍长些。 循环次数：循环次数打算PCR 扩增程度。PCR 循环次数主要取决于模板DNA 的浓度。一般的循环次数选在 3040 次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。PCR 反响特点 特异性强：PCR 反响的特异性打算因素为：引物与模板DNA 特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA 聚合酶合成反响的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延长是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反响的忠实性及Taq DNA 聚合酶耐高温性，使反响中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进展，结合的特异性大大增加，被扩

11、增的靶基因片段也 就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。灵敏度高：PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒3PCR 培训教材的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为 3 个细菌。简便、快速：PCR 反响用耐高温的Taq DNA 聚合酶，一次性地将反响液加好后，即在DNA 扩增液和水浴锅上进展变性-退火-延长反响，一般在 24 小时完成扩增反响。扩增产物一般用电泳分析，不愿定要用同位素，

12、无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低：不需要分别病毒或细菌及培育细胞，DNA 粗制品及总RNA 均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的 DNA 扩增检测。 三、PCR 仪：随着分子生物学的创立与进展，PCR 测定方法作为一门崭的技术已经在遗传疾病的诊断、临床标本中病原体核酸的检测、激活癌基因中突变状况的分析、法医学上的遗传学鉴定以及分子克隆诸方面得以越来越广泛的应用。实现这项技术的工具DDPCR 扩增仪也应运而生。PCR 扩增仪是整个PCR 试验关键的仪器，它性能的好坏打算着试验结果的准确性。而仪器的恒温存变温的性能是打算基因片段完成变性、退火

13、、延长的最重要的参数。目前国内用户使用的PCR 扩增仪品牌很多，原理和样本载量也不尽一样。下面测重给大家从恒温存变温两方面介绍各类扩增仪的原理：1. 梯度水浴法：这种方法一般是水浴槽加上机械臂构造。仪器上设有3 个不同温度的水浴槽，通过机械臂携带样品管在这 3 个槽中浸泡，完成变性、退火、延长 3 个过程。其优点是温度变化快，时间准确，温度可调，省时省力，价格较低。缺点是以室温温度为下限，不能实施简洁的操作过程。2. 空气驱动循环恒温装置：本系统用空气作为热传导媒介。外壳承受商品化的家用对流恒温器(烘箱)的外壳，热源包括两局部：强热气由热空气枪来供给，大功率风扇为制冷供给外部空气，或由冷室或更

14、简洁设备产生冷空气。这种装置的优点是不用金属的周密加工，可使本钱降低。整个系统不承受制冷液，安全程度高。同时以测定管内温度为控温依据，显示温度真实牢靠。缺点是受环境温度影响大，各管的均一性需要严密的设计才能得以保证。3. 变温金属块作恒温装置：此类扩增仪中心是一个热块，上面均匀分布 48 或 96 孔， 放专用的样品管，内壁加工周密，保证和反响管严密接触。热块由其下部的电阻丝加热升 温，并由微机把握恒温。冷却承受压缩机制冷，可快速制冷，温度变化速率大于1/秒。 该系统用微机把握，扩增周期的循环条件可选择或编辑，程序可储存。该系统如有加热盖， 样品管中则无需参与矿物油。国内常见的PCR 扩增仪：

15、由于各种PCR 扩增仪的原理不同，其发热、制冷机制的方式都不尽一样。国外产品的特点是产品的质量和性能比较稳定。缺点是价格高，且修理麻烦。而国内仪器的性价比较高，售后效劳快捷准时。1、 9600 型DNA 扩增仪：(美国应用生物系统公司产品) 最大样本数：96 孔。 温度范围：499。4PCR 培训教材加热冷却速度：平均为 1/秒。温度精度：35100间误差小于 0.75。特点：具有加热盖，可防止样品蒸发，可扩增微量至5ul 的反响体积，记忆容量为150 个用户文件。2、 PTC-200 热循环仪：美国MJ Research 公司产品 (1)最大样本数：96 孔。(2)温度范围：-5105。(3

16、) 加热冷却速度：平均为 3.5/秒。(4)温度精度：35100间误差小于 0.3。(5)特点：承受可调压力和高度加热盖，样品管内无需加石蜡油，三种温控选择：模块、样本内参或电脑模拟计算。3、 GeneStar9625 扩增仪:(厦门安普利生物产品) (1)最大样本数：96 孔。(2)温度范围：4100。(3)加热冷却速度：平均为 2/秒。(4)温度精度：35100间误差小于 0.1。(5)特点：具有加热盖，可防止样品蒸发，样品管内无需加石蜡油，全自动门，本机使用全自动智能化门，开头扩增时机门自动关闭，完毕后机门自动翻开，安全牢靠。本机把握软件，充分考虑到PCR 技术的最进展的需要，允许用户对

17、扩增各步条件任意修改， 实现诸如Touch Down 功能等。目前国内比较流行的实时荧光定量PCR 仪则是在PCR 扩增仪的根底上参与了荧光检测系统，并由微机进展实时监控，使扩增检测一体化，我们将在后面为大家具体介绍PCR 实时荧光定量技术。 四、PCR 产物分析：PCR 产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确牢靠，必需对其进展严格的分析与鉴定， 才能得出正确的结论。PCR 产物的分析，可依据争论对象和目的不同而承受不同的分析方法。 凝胶电泳分析：PCR 产物电泳，EB 溴乙锭染色紫外仪下观看，初步推断产物的特异性。PCR 产物片段的大小应与估量的全都，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合估量的大小，这是起码条件。本方法包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。酶切分析：依据PCR 产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分别后，获得符合理论的片段，此法既能进展产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进展变异性争论。 分子杂交：分子杂交是检测PCR 产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。 Southern 印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR 产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR 产物的灵敏度， 还可知其分子量及条带外形，主要用于科研。5感谢您的阅读，祝您生活快活。