《生物化学》实验指导(8个实验).docx

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1、生物化学试验指导(8 个试验)生物化学试验指导吕杰编著疆大学资源与环境科学学院生态学教研室内容介绍生物化学试验指导是疆大学资源与环境科学学院生物化学课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学试验与实习教材的根底上，结合教师的教学阅历汇编而成。该实习指导围绕教学大纲设计了 8 个试验内容。目名目试验一氨基酸纸层析 4 试验二DNS-CL 法测定N 末端氨基酸 5 试验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度7 试验四酪蛋白的制备8 试验五葡萄糖标准曲线的绘制 10 试验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定12 试验七酵母RNA 的分别及组分鉴定 14 试验八维生素C 的定量测定 16 试验一一氨基酸纸层析

2、一、试验目的 1、通过氨基酸的纸层析分别， 学习纸层析的根本原理和操作方法。二、试验原理纸层析：是以滤纸作为支持物的安排层析法，是20 世纪 40 年月进展起来的一种生化分别技术。由于设备简洁，操作便利， 所需样品量少，区分力较高等优点而广泛的用于物质的分别，并可进展定性和定量的分析。缺点是开放时间较长。安排层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的安排系数不同，而到达分别的目的的一种试验方法。在肯定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的安排系数是一个常数即10=溶质在固定相的浓度/溶质在流淌相的浓度。溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力， 因而其集中作用降低形成固

3、定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流淌，形成流淌相，由于混合液中各种氨基酸的安排系数值不同，其在两相中的安排数量及移动速率即迁移率 Rf 值 就不同，从而到达分别的目的。三、试验材料、仪器和试剂：1、试验材料：标准氨基酸溶液 2、仪器:层析缸，层析纸，毛细管， 天平，吹风机等。3、试剂：1氨基酸标准溶液：0.1M 丙氨酸和 0.1M 谷氨酸标准溶液。2溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2体积比摇匀；3 0.1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮 15 克，丙酮 100 毫升四、试验步骤： 纸层析(1)取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿 2cm 处， 用铅笔轻轻的各画两条平行

4、线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔 2cm 画一个+作为点样位置，共 5 个点。(2) 点样：用毛细管点样，其中 2 个点用毛细管点上氨基酸的标准溶液；中间间隔一点，另2 点点上未知氨基酸的溶液。每个点样点重复点 5 次，每点一次用电吹风吹干后再点下次，点样点的直径应掌握在2mm 左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面对外，留意纸的两边不要接触。(3) 展层：向层析缸中参加层析溶剂，液层不要超过点样线高约1.5cm，约 5060ml 溶剂，将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，吹干。(4) 显色：用喷雾器将茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，吹风机热风

5、吹干显色。五五.结果分析：(1)用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；(2)测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离=原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离六、思考题：1、何谓安排层析法和安排系数？试验二二DNS-Cl 法测定N 末端氨基端一、试验目的 1、学习聚酰胺薄膜层析的方法。2、学习DNS-Cl 测定氨基酸的原理及方法。二、试验原理纸层析：是以滤纸作为支持物的安排层析法，是20 世纪 40 年月进展起来的一种生化分别技术。由于设备简洁，操作便利， 所需样品量少，区分力较高等优点而广泛的用于物质的分别，并可进展定性

6、和定量的分析。缺点是开放时间较长。安排层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的安排系数不同，而到达分别的目的的一种试验方法。三、试验材料、仪器和试剂：1、试验器材层析缸毛细管紫外灯烘箱恒温箱聚酰胺薄膜吹风机 2、试剂：各种层析纯标准氨基酸DNS-Cl 丙酮溶液称取25mgDNS-Cl 溶于10mL 丙酮中，贮于棕色瓶中，至于冰箱保存，一个月内稳定0.2mol/LNaHCO3 溶液NaOH1MHCl1M开放剂I88%甲酸：水=1.5:100v/v开放剂 II 苯：冰醋酸=9:1v/v四、试验步骤： 1、氨基酸的DNS 化分别取 0.2-0.3mg 的层析纯标准氨基酸及样品氨基酸溶于

7、0.5mL0.2mol/L 的NaHCO3 溶液中，各取 0.1mL 于有玻璃塞的试管中，参加 0.1mLDNS-CL 的丙酮溶液，测pH 值，必要时用NaOH 调pH 至 9.0-9.5，于室温放置 2-4h，冷风吹除丙酮后，加 HCl 调pH2-3水解 16-18h，参加乙酸乙酯抽提，分层后取有机相；2、聚酰胺薄膜的预备将聚酰胺薄膜剪成 7*7cm 的方块，在距边 0.5cm 处画互为垂直的两条基线，穿插点为原点，假设只做单向层析，则只画一条基线，在基线上每隔 1cm 画一个点样点。3、点样用毛细管取样，点在点样点上，点样点直径应小于2mm，假设屡次点样，点一次吹干一次。4、展层将点好样的

8、聚酰胺膜卷成圆筒形，点样侧在筒内，放入层析缸内，槽内参加 5-10ml 的开放液I 进展开放，溶剂到达距顶部 0.5cm 时，取出膜吹干。进展双向层析，第一向层析完毕，取出完全吹干，将膜转90，用展层液II 开放。为了区分 DNS-谷氨酸和DNS-天冬氨酸，DNS-苏氨酸和DNS-丝氨酸，DNS-丙氨酸和DNS-NH2，可在开放后，吹干，接着用其它展层液在同一方向上开放。5、DNS-氨基酸的检测展层完毕后，取出薄膜用吹风机吹干，在 360nm或者 280nm 紫外灯下检测，DNS-氨基酸应呈黄色荧光，用样品的层析谱与标准的DNS-氨基酸层析谱比较可鉴定样品氨基酸的种类。五、结果分析：(1)用铅

9、笔将层析荧光点描出来；(2)测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf 值。Rf=组分移动的距离/溶剂前沿移动的距离=原点至组分斑点中心的距离/原点致溶剂前沿的距离六、思考题：1、为什么用棉线而不是橡皮筋固定薄膜？试验三三考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质一、试验目的1.把握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法 2.娴熟分光光度计的使用和操作方法二、试验原理此方法是 1976 年Bradform 建立。考马氏亮蓝G-250 在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸取波长从465nm 转移到 595nm 处，在肯定的范围内，蛋白质含量与 595nm 的吸光

10、度成正比。大大提高了测定蛋白质的灵敏度1ug三、器材与试剂器材 1.可见光分光光度计 2.刻度移液管 3. 移液枪试剂 1.0.15M 生理盐水 2.考马斯亮蓝试剂(考马斯亮蓝G250100mg 溶于 50ml95%乙醇中，参加 100ml85%H3PO4，用蒸馏水稀释至 1000ml。最终试剂中含有 0.01%G250，4.7%乙醇，8.5%磷酸)3.0.1mg/ml 蛋白质标准液结晶牛血清蛋白，预先经凯氏定氮法测定蛋白氮含量，依据其纯度用 0.15M 生理盐水配制成 0.1mg/ml 蛋白溶液。4.两种未知浓度的蛋白质溶液。四、试验步骤 1.标准曲线的制作(1)取试管 6 支，按下表进展编

11、号并参加试剂。试剂试管编号 1234560.1mg/ml 标准蛋白溶液ml 00.20.40.60.81.00.9%生理盐水ml1.00.80.60.40.20 考马斯亮蓝溶液ml333333A595(2)参加 3.0ml 考马斯亮蓝G250 试剂,充分振荡混合，放置 5min 后，测定A595 值。(3)分光光度法的根本原理和分光光度计的使用方法(4)A595 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。2.未知溶液蛋白质含量的测定(1)未知蛋白质溶液:取试验室预备的未知蛋白质溶液，各吸取样品提取液 0.1ml，参加考马斯亮蓝G250 试剂 3.0ml，充分振荡混合，放置 5min 后，测

12、A595 值(2)依据A595 值，在标准曲线上求出样品中蛋白含量。(3)假设所测定的A595 值不在标准曲线内，该如何处理？3.结果计算依据标准曲线求出样品中蛋白质的含量。五、复习思考题、作业题：1.Bradford 法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何抑制不利因素对测定的影响？2为什么标准蛋白质必需用凯氏定氮法测定纯度？ 3.依据蛋白质的呈色反响，测定蛋白质的方法还有哪种？依据所学学问推断各种测定方法有何优点、缺点试验四酪蛋白的制备一、试验目的1、学习从奶粉中制备酪蛋白的原理和方法。2、把握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。二、试验原理牛的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些

13、含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH 调至 4.7 时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。三、材料、试剂与器具一材料颖牛奶一试剂 1、95%乙醇1200mL2、无水乙醚 1200mL3、0.2mol/LpH4.7 醋酸醋酸钠缓冲液 300ml 先配A 液与B 液A 液：0.2mol/L 醋酸钠溶液称NaAC3H2O54.44g，定容至 2023ml。B 液：0.2mol/L 醋酸溶液，称优纯醋酸含量大于 99.8%12.0g 定容至 1000ml。取A 液 1770ml，B 液 1230ml 混合即得Ph4.7 的醋酸

14、醋酸钠缓冲液3000ml。4、乙醇乙醚混合液乙醇：乙醚=1：1V/V二器具1、离心机 2、抽滤装置 3、周密pH 试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计四、操作步骤一酪蛋白的粗提 100mL 牛奶加热至 40。在搅拌下渐渐参加预热至 40、pH4.7 的醋酸缓冲液 100mL.用周密pH 试纸或酸度计调pH 至 4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心 15 分钟3000r/min。弃去清液，得酪蛋白粗制品。二酪蛋白的纯化1、用水洗涤沉淀3 次，离心10 分钟3000r/min，弃去上清液。2、在沉淀中参加30mL 乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇乙醚混合液洗沉淀 2

15、 次。最终用乙醚洗沉淀 2 次，抽干。3、将沉淀摊开在外表上，风干；得酪蛋白纯品。三准确称重，计算含量和得率。含量：酪蛋白g/100mL 牛乳g%100% 测得含量得率:理论含量式中理论含量为 3.5g/100mL 牛乳。五、留意事项 1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调整牛奶液的等电点肯定要准确。最好用酸度计测定。2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯洁牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。六、试验报告 1、依据实际操作，以流程图形式总结酪蛋的制备方法。2、合理分析试验所得率七、思考题 1、制备高产率纯酪

16、蛋白的关键是什么？2、试设计另一种提取酪蛋白的方法？试验五五葡萄糖标准曲线的绘制一、试验目的把握葡萄糖标准曲线的绘制方法，进一步把握分光光度计的使用。二、试验原理复原糖的测定是糖定量测定的根本方法。复原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是复原糖，双糖和多糖不肯定是复原糖，其中乳糖和麦芽糖是复原糖，蔗糖和淀粉是非复原糖。复原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被复原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。在肯定范围内，复原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中复原糖和总糖的含量。由

17、于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需参加一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。HOOCNOOHNO22+复原糖NOOHNH22(DNS)3氨基5硝基水杨酸?HOOC 三、试验材料、主要仪器和试剂1主要仪器1玻璃试管：20mL72刻度吸管：（3） 容量瓶：（4） 恒温水浴锅5沸水浴6离心机7天平8分光光度计 2试剂11mg/mL 葡萄糖标准液准确称取 80烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL，混匀，4冰箱中保存备用。23,5-二硝基水杨酸DNS试剂将 6.3gDNS 和 262mL2mol/LNa

18、OH 溶液，加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。四、操作步骤 1制作葡萄糖标准曲线取 7 支 20mL 具塞刻度试管编号，按表 1 分别参加浓度为 1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5-二硝基水杨酸DNS试剂，配成不同葡萄糖含量的反响液。表1 葡萄糖标准曲线制作管号1mg/mL 葡萄糖标准液mL蒸馏水mL DNSmL葡萄糖含量mg O.D.540nm0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.

19、851.01.01.51.061.20.81.51.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至 20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进展比色。调波长 540nm，用 0 号管调零点， 测出 16 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量mg 为横坐标，绘出标准曲线。五、结果与计算：用电脑绘出的标准曲线，写出回归方程。六、留意事项 1标准曲线制作时各反响管应同时进展沸水浴加热， 并准确进展定容。七、思考题 1如何正确绘制和使用标准曲线?试验六六酵母蔗糖酶的提取及其性质的争论一、试验目的本试验为学生供给一个较全面的实践时机，学习如何提取纯化、分析鉴定一

20、种酶， 并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的争论。二、试验原理至今我们所觉察的大多数酶都是蛋白质，因而蛋白质的分别提纯方法也适用于酶。对于不同来源的各种酶，通常承受盐析沉淀、吸附、离子交换、结晶及各种物理化学方法将它提纯，在纯化过程中，应尽量避开高温，猛烈的机械搅拌、强酸、强碱等简洁造成蛋白质变性的各种剧烈条件。蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。因此只要用一种适当的试剂测定反响中复原糖的含量，就可以得知它的活力。蔗糖酶在碱性环境中格外简洁失活，因此可以用碱来终止酶促反响。试验中的蔗糖酶活力测定是在 35下进展活力测定，每三分钟能使5%蔗糖溶液释放 1 毫克复原糖的酶量定为

21、一个活力单位。复原糖的测定是利用 3,5-二硝基水杨酸与葡萄糖生成红色化合物，通过比色法测定复原糖的量即为酶活力。三、试验仪器 1试管，2.量筒，3三角瓶，4滴管，玻棒，5分光光度计，温箱，冰箱，离心机，恒温水浴，水浴锅，温度计。三、试剂 1、1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取 80烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL，混匀，4冰箱中保存备用。2、3,5-二硝基水杨酸DNS试剂将6.3gDNS 和 262mL2mol/LNaOH 溶液，加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g

22、结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。3、0.lmol/L 醋酸缓冲液(pH4.6：0.2mol/L 醋酸溶液11.55mL 冰醋酸定容至1 升，25.5mL 与 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gNaAc 或 27.2gNaAc3H2O 定容至 1 升24.5mL 混合稀释到 100mL。4、5%蔗糖溶液W/V：5 克蔗糖以pH4.6 的 0.1mol/L 醋酸缓冲液溶解，定容至 100mL。5、5mmoL/L 的磷酸钠缓冲液 6、0.5mL1mol/L 的NaOH 四、操作：1.蔗糖酶粗制品的提取：取 10 个g 干酵母，参加 2.5g

23、硼砂，少许石英砂，逐步参加5mmoL/L 的磷酸钠缓冲液适当参加，充分研磨 30min，然后 4000r/min 离心 15 分钟，记录上清液总体积，为蔗糖酶的粗制品。2葡萄糖浓度测定l葡萄糖标准曲线制作取 11 支试管按下表挨次参加 1mg/mL 葡萄糖液，水及 3,5-二硝基水杨酸试剂DNS。管号 1mg/mL 葡萄糖标准液mL蒸馏水mLDNSmL葡萄糖含量mgO.D.540nm 0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2 上述溶液混合均匀后在沸水浴中加热5 分钟

24、，取出马上用冷水冷却，以蒸馏水稀释至 25mL，摇匀，测 540nm 光密度O.D 值。以葡萄糖含量mg为横坐标，光密度值为纵坐标做出标准曲线。2样液的测定取四只试管分别参加 2mL 稀释的酶液。1 支作比照，参加 0.5mL1mol/L 的NaOH 摇匀，使酶失活。另 3 支作测定管。此 4 支试管和 5%蔗糖溶液放在 35水浴中预热 10 分钟。分别吸取2mL5%蔗糖液于上述四支试管中，并且准确计算时间，3 分钟后在测定管中也参加 0.5mL1mol/LNaOH，摇匀整个反响在 35下进展。管号稀释酶液mL1mol/LNaOHmL5%蔗糖mL1比照20.535之前2220.53 分钟后马上

25、参加2320.53 分钟后马上参加2420.53 分钟后马上参加2 从反响混合物中吸取 0.45mL 溶液，用DNS 试剂测定酶反响生成的复原糖数量方法同标准曲线的制作，反响混合液中参加 1.55mL 的蒸馏水，再参加 1.5mL 的DNS。以管 1 作为比照，管 2、3、4 为测试管。管 2、3、4 测定的OD 值进展平均，带入标准曲线的回归方程，计算出蔗糖酶在 35下，以 5蔗糖为底物时，3 分钟能释放出的复原糖的总毫克数，此数值即为总活力单位。试验七酵母ARNA 的分别与组分鉴定一、试验目的： 学习稀碱法提RNA 的原理与技术。二、试验原理：由于RNA 的来源和种类很多，因而提取制备方法

26、也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是试验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA 即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA 和蛋白质则留在酚层中，向水层参加乙醇后，RNA 即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去 DNA 和蛋白质。上述方法提取的 RNA 具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这 2 种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简洁。浓盐法是用 10%左右氯化钠溶液，90提取 34h，快速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱本试验用 0.2%NaOH 溶液使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质

27、和菌体后的上清液用乙醇沉淀 RNA本试验 或调pH2.5 利用等电点沉淀。提取的RNA 有不同程度的降解。酵母含RNA 达 2.6710.0%，而DNA 含量仅为 0.030.516%，为此，提取RNA 多以酵母为原料。三、器材与试剂： 1器材：干酵母粉市售。鲜酵母市售。pH 试纸pH110。台天平100g。烧杯 100mL1。量筒 50mL1、10mL1。抽滤瓶 500mL1、布氏漏斗 10cm1。吸管 0.5mL1、1mL2、2mL2、5mL1。离心机 5000r/min。2试剂：0.2%氢氧化钠溶液：2gNaOH 溶于蒸馏水并稀释至 1000mL。乙酸AR。95%乙醇。无水乙醚CP。氨水

28、CP。10%硫酸溶液：浓硫酸比重 1.8410mL，缓缓倾于水中，稀释至100mL。5%硝酸银溶液：5gAgNO3 溶于蒸馏水并稀释至 100mL，贮于棕色瓶中。苔黑酚三氯化铁试剂：将 100mg 苔黑酚溶于 100mL 浓盐酸中，再参加 100mgFeCl36H2O。临用时配制。定磷试剂 17硫酸溶液：将 17mL 浓硫酸缓缓参加到 83mL 水中；2.5钼酸铵溶液：将 2.5g 钼酸铵溶于 100mL 水中。10抗坏血酸溶液：10g 抗坏血酸溶于 100mL 水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效，需纯化抗坏血酸。 临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合。 17硫酸溶

29、液：2.5钼酸铵溶液：10抗坏血酸溶液：水1：1：1：2V/V四、操作步骤：1. RNA 的提取：置 4g 干酵母粉于 100mL 烧杯中，参加 0.2%NaOH 溶液 40mL，沸水浴加热 30 分钟，常常搅拌。参加乙酸数滴，使提取液呈酸性石蕊试纸，离心 10-15 分钟4000r/min。取上清液30ml 左右，参加 95%乙醇 30mL，边加边搅。加毕，静置，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95%乙醇洗 2 次每次约 10mL，继用无水乙醚洗 2 次每次 10mL，洗涤时可用细玻棒留神搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可作鉴定(全部用离心的方法)。2. 鉴定：取上述RNA 约 0.5g，

30、加 10%硫酸液 5mL，加热至沸 1-2 分钟，将RNA 水解。（1） 取水解液 0.5mL，加苔黑酚FeCl3 试剂 1mL，加热至沸 1 分钟， 观看颜色变化。（2） 水解液 2mL，加氨水 2mL 及 5%硝酸银溶液 1mL，观看是否产生絮状嘌呤银化合物有时絮状物消灭较慢，可放置十几分钟。（3） 磷酸水解液2mL，参加定磷试剂1mL。水浴中加热，观看溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。五、结果与争论：1所得RNA 是否是纯品？如何进一步纯化？2RNA 提取过程中的关键步骤及留意事项有哪些？试验八八维生素C 的定量测定一、试验目的：1学习维生素C 定量测定的一般原理；2把握用 2，6-二

31、氯酚靛酚滴定法定量测定食物和生物体液中维生素C 的根本操作技术。二、试验原理：维生素C 是人类膳食中必需的维生素之一，假设缺乏维生素C，将导致坏血病发生。因此，维生素C 又称为抗坏血酸，有防治坏血病的成效。抗坏血酸在自然界分布格外广泛，存在于颖水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物如青辣椒、菠菜等中含量特别丰富。抗坏血酸的定量测定方法很多，有2，6-二氯酚靛酚简称DCIP滴定法、碘滴定法、2，4-二硝基苯肼法等。其中广泛承受的是DCIP 滴定法，它具有简便、快速、比较准确等优点，适用于很多不同类型样品的分析。缺点是不能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量，易受其他复原物质的干扰

32、。假设样品中含有色素类物质， 将给滴定终点的观看造成困难。在酸性环境中，抗坏血酸复原型能将染料 2,6-DCIP 复原成无色的复原型 2,6-DCIP，而抗坏血酸则被氧化成脱氢抗坏血酸。氧化型的 2,6-DCIP 在中性或碱性溶液中呈蓝色，但在酸性溶液中则呈粉红色。因此，当用 2,6-DICP 滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸未被全部氧化前，滴下的 2,6-DCIP 马上被复原成无色，一旦溶液中的抗坏血酸全部被氧化时，则滴下微量过剩的 2,6-DCIP 便马上使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。依据滴定时 2,6-DCIP 标准溶液的消耗量

33、mL，可以计算出被测样品中抗坏血酸的含量。氧化型 2,6-DCIP 与复原型抗坏血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中进展反响。即先将样品溶于肯定浓度的酸性溶液中或经抽提后，再用 2,6-DCIP 标准溶液滴定至终点。其反响式如下：本试验承受 2,6-二氯酚靛酚滴定法，以颖水果、蔬菜和生物体液为分析材料，进展抗坏血酸含量测定。三、器材及试剂 1器材：市售果汁；吸管；容量瓶；锥形瓶；微量滴定管；天平；抽滤装置 2试剂：2%草酸溶液：草酸 2g，溶于 100mL 蒸馏水。2%草酸液可用 4%偏磷酸醋酸溶液代替1%草酸溶酸：溶1g 草酸于 100mL 蒸馏水。标准抗坏血酸溶酸：准确称取50.0mg 纯抗坏血酸

34、，溶于 1%草酸溶液，并稀至 500mL。贮棕色瓶、冷藏，最好临用时配制。1%HCl 溶液。0.1%2,6-二氯酚靛酚溶液：溶 250mg2，6-二氯酚靛酚于 150mL 含有 52mgNaHCO3 热水中，冷却后加水稀释至 250mL，滤去不溶物，贮棕色瓶内，冷藏4约可保存一至三周。每次临用时稀释 10 倍， 并以标准抗坏血酸溶液标定。四、操作步骤： 1样品提取滴定水果汁样品将果汁充分摇匀后，取 5mL 样品放入 50mL 容量瓶中，用2%草酸溶液溶液稀释，并定容至50mL，混匀后通过快速滤纸过滤或离心。取滤液10mL 放入锥形瓶内，马上用已标定过的 2,6-DCIP 溶液快速滴定至样品液呈

35、现玫瑰色，并保持15-20s 不变即为终点，记录所消耗的2,6-DCIP 溶液的体积(mL)。样品液中抗坏血酸含量宜在 0.1-0.2mg/mL 范围内，假设偏高或偏低则可酌情增减样品用量或进展适当稀释。另取 10mL 蒸馏水作空白比照滴定 1 份。样品液滴定 3 份，滴定结果取平均值。22,6-二氯酚靛酚溶液的标定准确吸取标准抗坏血酸溶液 1.0mL含0.1mg 抗坏血酸置 100mL 锥形瓶中，加 9mL1%草酸，用滴定管以稀释 10 倍的 2,6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持 15 秒钟不褪色即为终点。由所用染料的体积计算出1mL 染料相当于多少mg 抗坏血酸。五、结果与争论：1. 计

36、算：抗坏血酸mg/100g 样品= 坏血酸mg 数。WTVVBA100T=1mL 染料能氧化抗W=10mL 样液相当于含样品之g 数。VA 为滴定样品时所消耗的染料mL 数平均值；VB 为滴定空白时所消耗染料的mL 数。2. 争论：本法测定VC 的利与弊。注：2%草酸可抑制抗坏血酸氧化酶，1%草酸因浓度低不能完成上述作用。偏磷酸有同样成效。假设样品中含有大量Fe2+可用 8%醋酸溶液提取，如仍用偏磷酸或草酸为提取剂，Fe2+可以复原二氯酚靛酚，如用醋酸则Fe2+不会很快与染料起作用。故可用 4%偏磷酸-醋酸液代替2%草酸液。如浆状物泡沫很多，可加数滴辛醇或丁醇。假设浆状物不易过滤，可离心取上清液测定。如滤液颜色太深，滴定时不易区分终点，可先用白陶土脱色。样品中某些杂质亦能复原 2,6-二氯酚靛酚，但速度均较抗坏血酸慢，故终点以淡红色存在 15 秒钟为准。六、思考题 1提取VC 时，参加 2%草或 4%偏磷酸-醋酸液的作用是什么？2假设提取液颜色太深而又无法脱尽，严峻影响滴定终点推断时，是否有其它方法能准确推断出终点？