a淀粉酶发酵的生产工艺.docx

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1、 ，学问共享！武汉轻工大学设计 -淀粉酶的发酵生产工艺系部食品科学与工程学院专业粮食 工程班级 粮工 1002姓名 郑 开 旭学号 100107502指 导 教 师 易阳2023 年 6 月 9 日设计-淀粉酶发酵的生产工艺摘要:-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前，- 淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发 酵以及纺织等很多行业。本次设计的淀粉酶发酵，分别以玉米粉为碳源，以豆饼为氮源，以BF-7658枯草芽孢杆菌为生产菌种,同时做出了生产工艺流程图，具体的介绍了-淀粉酶的

2、生产工艺。关键词：-淀粉酶；工艺设计；发酵正文:1 -淀粉酶的生产方法1.1 生产方法的选择-淀粉酶的生产工艺枯草杆菌BF7658是我国应用广泛的液化型-淀粉酶菌种，国内普遍承受深层发酵法生产工业粗酶。我们从BF7658动身，用紫外光及化学药品反复交替诱变， 选育适用于固体发酵的菌体BF76581。该菌为短杆状，革兰氏阳性，两端钝园，在肉汁外表可生成菌膜，在培育基上菌落呈乳白色，外表光滑、潮湿、略有光泽，用碘液试之，菌落四周呈透亮圈。 固体培育枯草杆菌BF76581生产-淀粉酶将菌种接种于马铃薯琼脂斜面，37培育三天，然后转接到种子液体培育基上 豆饼粉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨火碱、水等，摇瓶培

3、育肯定时间， 当菌体进入对数生长期时，以0. 5%接种量接入固体培育基麸皮、米糠、豆饼粉、火碱、水；ph=7左右，常压汽蒸一小时，冷却到3840在厚层通风制曲箱内，通风保持3742，培育48小时出曲风干。麸曲用1食盐水34倍浸泡，3小时后过滤，调整滤液pH=8，加硫酸铵溶液沉淀酶，经离心，用浓酒精洗涤脱水，40烘干、磨粉即为成品。 深层发酵法生产-淀粉酶斜面菌种制法同前。将试管斜面菌种接种到马铃薯茄子饼斜面培育基同前种子培育基，37培育三天，使之形成芽孢，以提高种子的稳定性。然后接种到500升种子罐，37搅拌通风培育1214小时。当菌体进入对数生长期镜检细胞密集、粗大整齐、大多数细胞单独存在，

4、少数呈链状，发酵液=6.36.8， 酶活510单位毫升时，乃转入10000升发酵罐，37，通风，搅拌，培育4048小时。中途三倍碳源的培育基补料，体积相当于根底料的13，从培育12小时开头，每小时一次，分30余次添加完毕。停顿补料后68小时罐温不再上升，菌体年轻，80形成空泡，每23小时取样分析一次，当酶活不再上升， 可完毕发酵。而后向发酵液中添加2%CaCl2，0.8%Na2HPO4，5055加热处理30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体分散而易于过滤。冷却到35，参加硅藻土为助滤剂过滤。滤液加2.5倍水洗涤，洗涤同发酵液混合，真空浓缩数倍后，加NH42SO4盐析，盐析物加硅藻土后压滤，滤饼

5、于40烘干，磨粉而成。按此工艺，由酶液到粉状酶制剂的收率为70。对于固体发酵有以下缺点：1. 限于低湿状态下生长的微生物，故可能的流程及产物较受限，一般较适合于真菌。2. 在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题，尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能。3. 固态下各项参数不易侦测，尤其是液体发酵的各种探针不适用于固体发酵，pH值、湿度、基质浓度不易调控，Biomass不易量测，每批次发酵条件不易全都，再现性差。4. 不易以搅拌方式进展质量传递，因此发酵期间，物质的添加无法到达均匀。5. 由于不易侦测，从发酵工程的观点来看，很多工作都只是在定性或观看性质，故不易设计反响器，难以量化生产或

6、设计合理化的发酵流程。6. 固体发酵的培育时间较长，其产量及产能常低于液体发酵。7. 萃取的产物常因黏度高不易大量浓缩。 而对于发酵罐深层培育具有生产周期短、产量高、效益大等优点应选用层发酵法生产-淀粉酶。1.2 -淀粉酶培育基的制作（1） 培育基的类型培育基的种类很多，可以依据组成、状态和用途等进展分类，依据用途可以分成孢子培育基，种子培育基和发酵培育基。微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培育基这三种类型。（2） 孢子培育基孢子培育基配制的目的是供菌体生殖孢子的，常承受的是固体培育基，对这类培育基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异。对孢子培育基的

7、要求：养分不要太丰富；所用无机盐的浓度要适量；留意培育基的pH和湿度。-淀粉酶的孢子培育基配置如下：将麸皮5、豆饼粉3、蛋白胨0.25%、琼脂2%pH 7.1制成斜面培育基，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min 。（3） 种子培育基种子培育基是供孢子发芽、生长和大量生殖菌丝体，并使菌丝体长得粗大成为活力强的种子。对于种子培育基的养分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以淡薄为好，可以到达较高的溶解氧，供大量菌体生长和生殖。-淀粉酶的种子培育基的配置：将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成种子培育基(pH 7.17.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。

8、（4） 发酵培育基发酵培育基的要求是养分要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求， 使菌种快速生长、强健，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的力量，但要留意本钱和能耗。-淀粉酶的发酵培育基配方是：麸皮70、小米糠20、木薯粉10%、烧碱0.5%，加水使水量达60，常压蒸汽灭菌1h.本发酵属于一级种子罐扩大培育，二级发酵。设计流程如下： 孢子锥形瓶种子罐发酵罐1孢子制备将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35静置培育24天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。(2) 种子制备将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面20%马铃薯煎出汁加MgSO47H2O 5

9、 mg/L，琼脂2%，pH 6.77.0，37培育3天。然后接入到20L种子罐，37 搅拌，通风培育1214小时。此时菌种进入对数生长期镜检细胞密集，粗大整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH 6.36.8,酶活510U/mL， 再接种到发酵罐。(3) 发酵罐培育培育基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6、豆粕水解液67、Na2HPO412H2O0.8、(NH4)2SO4 0.4、CaCl2 0.2、NH4Cl0.15、豆油1kg、深井水20L，调pH至 6.57.0。发酵罐培育基经消毒灭菌冷却后接入3%5%种子培育成熟液。培育条件 为：温度371，罐压0.5kgcm2，风量120h

10、为1：0.48vvm，20 h后1：0.67vvm，培 养 时 间 为 28 36 h。二此培育基的制备1. 培育基的制备与灭菌发酵培育基：蛋白胨 5g，酵母膏 2.5g，葡萄糖 0.5g,可溶性淀粉 2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。分装于 100mL锥形瓶中，每瓶 50mL，121灭菌 20min。2. 接种与产酶培育接种环灼烧灭菌后，轻轻刮取斜面种子培育基中的少量菌体，接入液体培育基中，并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦，使菌体分散于液体中。37振荡培育 48 h。3. 离心将发酵液置高速冷冻

11、离心机中 10000r/min 离心 10 min，除菌体，上清液即为淀粉酶粗酶液。2 -淀粉酶的菌种选育-淀粉酶生产：以枯草芽孢杆菌 14140 为动身菌株,经亚硝基胍反复屡次处理和筛选生产 -淀粉酶。分别纯化：以CTAB/正丁醇/异辛烷构成反胶团系统,通过反胶团萃取方式纯化精制 -淀粉酶。最正确反响条件为：萃取温度 40，水相组成为 NaCl0. 03 mol/L，pH 12. 0，有机相：无机相=12，振荡时间 10 min；反萃取最正确条件为：温度 60，水相组成为 KCl3 mol/L，pH 4. 0，有机相无机相=21，反萃取振荡时间 10 min。在上述条件下，经过一个萃取与反萃

12、取循环后，-淀粉酶的萃取率最高可达 90. 78%。2.1 菌株与培育方法2.1.1 培育基BY 斜面培育基每 100 g 含可溶性淀粉 1 g ，牛肉膏 1 g，蛋白胨 1 g，酵母膏 0.2 g，NaCl 0.5 g，琼脂 2 g. BY 发酵培育基每 100 g 含可溶性淀粉 5 g，牛肉膏 1 g，蛋白胨 1.5 g，酵母膏 0.2 g，NaCl 0.5g，CaCl21 g。调整 pH7.0，经 121， 灭菌 30 min，备用。2.1.2 仪器设备全自动高压灭菌锅、培育皿、恒温培育箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH 试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试

13、管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。2. 2试验方法2.2.1 细菌的分别与初步鉴定：将土壤系列稀释，把 10-3 、 10-4、10-5 分别涂布到淀粉培育基上，27倒置培育 2 天，将长出的菌落接入斜面。将细菌从斜面接种到淀粉培育基培育 2 天， 用碘液染色，记录透亮圈大小和菌落直径，计算 D/d 值。保菌供下次试验用。2.2.2 紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培育基平板，将菌悬液涂布其外表；用紫外线处理平板 0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理 2 次重复；放到黑暗中倒置培育，37培育 48h，

14、分别计数诱变组和比照组平板上的菌落数，并计算致死率；参加碘液，分别测量诱变组和比照组菌落的透亮圈直径和菌落直径，计算 D/d 值；将 D/d 值最大的菌种保存到斜面培育基上。2.3 诱变方法以及变异菌株的筛选诱变动身菌株在完全培育基中培育至对数生长期后期。以NTG 为诱变剂，按肯定处理剂量 (g/ml)，在肯定pH 值的缓冲液中30恒温振荡处理 14 h。经高速离心分别，移植于液体完全培育基进展后培育。经稀释涂布在含有 1%淀粉 BY 固体培育基上，经 24 h 培育形成小菌落。把单菌落分别移植于含 2%淀粉 BY 液体培育基中，30培育 36 h。用 2#定性滤纸制成 5 mm disc(小

15、圆纸片)，并用 2%琼脂 BY 培育基灭菌后参加较大剂量青霉素(抑菌)。倒入 200 mm300mm 长方形不锈钢玻璃培育皿中， 冷却凝固。然后把 5 mm disc 纸挨次放在培育基外表。用微量注射器分别吸取培育液，移植到相应的 disc 上。把 disc 培育皿经37，24h 分别培育。把 KI-I2 液用喷雾器均匀分布在 disc 培育皿培育基的外表上，并挑出淀粉水解圈大的 disc，用相对应的 1 ml 培育液接种摇瓶，进展发酵测定酶活力。把各种斜面菌株经活化培育，接种于 1%淀粉培育基的三角瓶中，进展摇瓶比较试验。将菌株作逐一比照，从中筛选出酶活较高的产酶菌株。经菌种诱变选育 - 淀

16、粉酶高产菌株为诱变的动身菌株，经 NTG 反复屡次处理，并经淀粉水解圈初筛和摇瓶复筛，来选育 -淀粉酶高产菌株。经 NTG 反复屡次处理，-淀粉酶活力有较大幅度提高。在经 5 次 NTG 处理之后，其变异株 -淀粉酶活到达 34 200 (U/ml)，较动身菌株提高了 4.2 倍以上， 说明该诱变处理及选育方法是行之有效的。经 NTG 处理所得的变异菌株的产酶稳定性较差,必需经反复屡次单菌落分别和摇瓶比较，渐渐筛选出产酶稳定性好的菌株。3 -淀粉酶分别纯化：-淀粉酶分别纯化及活性测定方法粉酶分别纯化及活性测定方法粉酶分别纯化及活性测定方法粉酶分别纯化及活性测定方法3.1 -淀粉酶的分别和纯化：

17、高纯度 淀粉酶是一种重要的水解淀粉类酶制剂，可用于争论酶反响机理和测定生化反响平衡常数等。分别纯化淀粉酶的方法很多，一般都是依据酶分子的大小、外形、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质建立的。要得到高纯度 淀粉酶，往往需要将各种方法联合使用。 盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析和电泳等，是蛋白质分别纯化的主要方法。通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸性 一淀粉酶进展纯化，得到电泳纯级的超耐热耐酸 一淀粉酶，纯化倍数为 11.7，活力回收率为 29.8%。但上述方法存在的共同问题是，连续操作和规模放大都比较困难。

18、 反胶团萃取具有选择性高、正萃与反萃可同时进展、分别与浓缩同步进展、操作简洁和易于放大等优点，并能有效防止生物分子变性失活。以CTAB /正丁醇/异辛烷构成反胶团系统，通过反胶团萃取方式纯化精制 -淀粉酶。最正确反响条件为: 萃取温度 40 ， 水相组成为 NaCl 0.03 mol/L，pH 12.0，有机相：无机相= 1：2， 振荡时间 10min； 反萃取最正确条件为:温度 60， 水相组成为 KCl 3 mol/L，pH 4.0, 有机相：无机相= 2 ：1， 反萃取振荡时间 10 min 。在上述条件下，经过一个萃取与反萃取循环后，淀粉酶的萃取率最高可达 90. 78%。双水相技术具

19、有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。应用双水相系统 PEG磷酸盐分别纯化 淀粉酶，增加 PEG 浓度有助于酶富集上相。同样用 PEG磷酸盐双水相体系从发酵液中直接萃取分别低温 一淀粉酶，安排系数及回收率分别为 4.8 和 87。承受 PEG(聚乙二醇)硫酸铵双水相体系，进展分别纯化 淀粉酶，结果说明，在室温下由 PEG 和硫酸铵所组成的双水相体系，对 淀粉酶的回收率可达 94.84，安排系数可达 17.10。双水相技术有着溶液粘度高、分相时间长，易造成界面乳化等缺点，给实际操作带来很多问题。为了获得高纯度的 一淀粉酶，开头人们利用软基质的离子交换色谱和亲和色谱分别纯化了 - 淀

20、粉酶的粗酶提取液。但是，软基质色谱介质的机械强度小，受压易变形，分析速度慢，分别效率低，柱寿命短，固定相对 PH、离子强度和压力格外敏感，反复使用时配体碎片简洁脱落。由于以上缺点，软基质色谱有渐渐被硬基质色谱取代的趋势。在硬基质色谱应用方面，李华儒等首次合成一种对 一淀粉酶具有特异亲和力量的色谱介质，并成功地分别纯化了工业粗酶，获得了高纯度产品，其活性回收率88%，Kato 等也用高效疏水色谱纯化了 -淀粉酶粗品，回收率为90%。之后其承受高效液相离子交换色谱纯化 一淀粉酶很好地分别了 一淀粉酶粗品， 其活性回收率高达 96%，比活性达 388/mg 蛋白质。此法的争论成功为大规模制备高纯度

21、一淀粉酶供给了一个工艺路线。3.2 试验方法（1） 反胶团系统的配置将适当比例的正丁醇和异辛烷参加比色管，摇匀。再参加适量 CTAB，放入加热套中加热溶解，摇匀，使其均匀分布于有机相， 得到澄清透亮稳定的反胶团系统。（2） 前萃取 将 -淀粉酶溶解于不同缓冲液中，稀释，并用 4 层干净纱布滤清。磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH(pI)，构成初始水相。将反胶团相和水相置于 50 mL 带塞三角烧瓶中，在振荡器上猛烈摇摆后(250 r/min, 10 min)，倾入离心管，进展离心(3 500 r/min, 5 min) ，用滴管留神地将两相分开取上层有机相待用。（3） 反萃取用去离子水配制适当 p

22、H 值(pHpI)和离子强度的缓冲液作为反萃取水相，与前萃取所得的有机相混合，放入恒温水浴锅加热片刻，在振荡机上猛烈摇摆后(250 r/min，10 min)，倾入离心管，进展离心(3500 r/min，5 min)。用滴管留神地将两相分开，下层水相即为纯化的淀粉酶。3.2.1 分析和测试方法（1） -淀粉酶活力的测定，承受国标 QB/180393，对萃取前的粗酶以及萃取后的精制酶的酶活力进展测定，依据所附“吸光度和淀粉酶酶浓度比照表”。将吸光度换算为酶活浓度 c，进而求出酶活 D660。按下式计算：D660=cn式中：c测试酶液浓度，u/g； n样品的稀释倍数，g/mL。平行试验相对误差不得

23、超过 2%。（2） -淀粉酶萃取率 E：按下式计算：E=反萃取水相中酶的总活力分相前参加的酶总活力100%工艺流程图如下5. 结论：提高 B.subtilis-淀粉酶酶活可通过打破基因调控机制和优化环境因素协同作用来实现。经 NTG 反复屡次对 B. subtilis 菌株进展诱变处理，在肯定程度上打破了酶合成调控机制和酶分泌调整机制，从而获得了 -淀粉酶高产变异株。CTAB/正丁醇/异辛烷反胶团系统萃取工业级 -淀粉酶的最正确条件为：萃取温度40，水相组成为 NaCl0. 03 mol/L， pH 12. 0，有机相无机相=12，振荡时间 10 mi；反萃取温度60，反萃取水相组成为：KCl3 mol/L，pH 4. 0，有机相： 无机相=2：1，反萃取振荡时间10 min。在上述条件下,经过一个萃取与反萃取循环后，-淀粉酶的萃取率最高可达 90.78%。反胶团萃取分别酶具有单级萃取率高、能实现连续操作等优点，可望进展成为一种生物产品分别的方法。6. 参考文献食品生物技术导论