PCR实验常见问题、原因分析及其解决方案.docx

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1、PCR 试验常见问题、缘由分析及其解决方案！PCR 产物的电泳检测时间，一般为 48h 以内，有些最好于当日进展检查，大于 48h 后带型不规章甚至消逝。但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的推断，具体归类为以下常见的 4 点，描述如下：问题一：无扩增产物现象：正比照有条带，而样品则无。缘由：1、模板:含有抑制物，含量低。2、Buffer 对样品不适宜。3、引物设计不当或者发生降解。4、反响条件：退火温度太高，延长时间太短。对策：1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA 或加大模板的用量。2、更换Buffer 或调整浓度。3、重设计引物避开链间二聚体和链内二级构造或者换一管引物。4、降低

2、退火温度、延长延长时间。问题二：非特异性扩增现象：条带与估量的大小不全都或者非特异性扩增带。缘由：1、引物特异性差。第 1 页共 3 页2、模板或引物浓度过高。3、酶量过多。4、Mg2+浓度偏高。5、退火温度偏低。6、循环次数过多。对策：1、重设计引物或者使用巢式PCR。2、适当降低模板或引物浓度。3、适当削减酶量。4、降低镁离子浓度。5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法。6、削减循环次数。问题三：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear 状态。缘由：1、模板不纯。2、Buffer 不适宜。3、退火温度偏低。4、酶量过多。5、dNTP、Mg 2+浓度偏高。6、循环次数过多。对策：1、纯化模板。2、更换Buffer。3、适当提高退火温度。4、适量用酶。5、适当降低dNTP 和镁离子的浓度。6、削减循环次数。问题四：假阳性现象：空白比照消逝目的扩增产物。缘由：靶序列或扩增产物的穿插污染。对策：1、操作时应留神轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。2、除酶及不能耐高温的物质外，全部试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3、各种试剂最好先进展分装，然后低温贮存。