生化分离原理与技术思考题答案.docx

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1、生物分离原理与技术知识点汇总第一章绪论1、各类分离纯化技术分别利用了生物分子的哪些特性来实现分离？利用这些 性质进 行分离的方法有哪些？形状和大小:凝胶过滤、超滤、透析;（2）电荷性 质：离子交换层析、电泳（除SDS）;极性（疏水性）：疏水层析、反相层析； 生物功能或特殊化学基团：亲和层析;（5）等电点pl:层析聚焦、等电聚焦、等 电点沉淀;溶解性:盐析、有机溶剂提取、结晶; 密度、大小:超离心、SDS-PAGE。 2、一个完整的分离纯化操作有哪些基本步骤？各个阶段所用的分离方法分别 侧重哪些指标？生化分离基本步骤：（1）选材：来源丰富，含量相对较高，杂 质尽可能少。（2）提取（预处理）：将目

2、的物从材料中以溶解状态释放出来，方 法与存在部位及状态有 关（3）分离纯化：核心操作,须根据目的物的理化性质， 生物学性质及具体条件确 定。（4）浓缩、结晶、干燥。（5）保存。整个过程应 有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果（收率、纯度）。第二章生物样品的预处理1、简述常用细胞破碎的主要方法、原理、特点、适用范围及细胞破碎今后的发 展方向。机械法：（1）胞捣碎法。原理：机械运动产生剪切力，适用于动植物组 织。（2）高速匀浆法。破碎程度较上法好，且机械剪切力对生物大分子的破坏 较小，处理量大。原理：利用高压使细胞悬浮液通过针型阀，由于突然的减压 和高速冲击撞击环使细胞 破碎。适用于：较柔软、易分散

3、的组织细胞。（3）研 磨法和珠磨法。由陶瓷的研钵和研杆组成，加入少量研磨剂（如精制石英砂、 玻璃粉、硅藻土。适用于微生物与植物细胞。（4）挤压法。微生物细胞在高压 下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破 碎。适用于细菌（G -）。物理法：（1）超声破碎。频率为20kHz以上的波， 超过人耳可听范围。其对细胞的破碎与空穴的形成有关。一般样品浓度、声强、 频率、介质的离子强度、pH、处理 时间都对破碎有影响。（2）反复冻融动物材 料。将材料深冷（T5 c-20 ）,形成 水晶，破坏胞膜疏水键，增加亲水性， 反复可破细胞。适用：动物材料。（3）渗透压冲击法。高渗突然低渗

4、，反复后 可造成细胞破碎，促使内含物释放。适用：处理胞壁较脆弱的微生物。（4）急热 骤冷法。将材料投入沸水，维持8590数分钟，冰浴中急速冷却，使胞壁结 构破坏。适用：细菌及病毒等中对热不太敏感的物质提取。（5）干燥法：热空 气干燥法适用于酵母，真空干燥法适用于细菌，冷冻干燥法适用于不稳 定的酶。 化学法：（1）溶剂处理法。丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶剂可溶解胞膜上脂质化 合物，使细胞结构破坏。（2）表面活性剂法。添加如十二烷基磺酸钠、去氧胆酸 钠等，通过破坏细胞膜而破碎细胞，释放目的物。此法常需与其它方法结合应 用。酶解法：（1）自溶法，将欲破碎细胞在一定条件（plL T）下保温一定时间， 通

5、过细胞本身存在的酶系的作用，将细胞破坏，使胞内物质释放。（2）外加酶法。 利用各种水解酶专一性地将细胞壁分解，使内含物释放出来。细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA）o酵母：采用葡聚糖酶。霉菌：添加几丁质的。 的pH使其满足吸附条件。I1IC的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合容量 的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加样。流动相A与流动相B流动相A 的缓冲液的种类、pH，盐的种类和浓度的选择：缓冲液种类据所需的pH选择， 注意目标物的稳定性，浓度一般在0. 010. 05moi/L；不同盐类对疏水作用的强 度有影响，层析中的选择性也不尽相同；盐浓度也随目标分 子的疏水性而异， （NH4

6、） 2S04常用0.752moi/L, NaCl为14mol/L流动相B为不含盐的缓 冲液，缓冲液与流动相A一致。23、请从原理、填料、应用范围几方面比较反相层析与疏水层析的主要差异。疏 水层析反相层析原理HTC介质与具有疏水性分子间的作用是由爆增和自由 能的变化所驱动的。高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成 空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。基于溶 质分子和固定相中键合在基质上的疏水性配基间的疏水相互作用。填料介质 的构成：基质：琼脂糖、纤维素、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯等；功能基 团（配基）：烷基和芳香基，包括：甲基、丙基、丁基、辛基、苯基等。

7、介质 的构成：基质：硅胶、聚苯乙烯 等；功能基团（配基）：正烷燃基团（n-烷基）， 常用的有辛基（C-8）和十八烷基（C-18）,其他还包括丙基、丁基、丙基苯基、 二苯基等。应用范围HIC已被广泛应用于生物分子特别是蛋白质的分离纯化 中，而且可作为变性蛋白色谱复性的主要应用技术。反相层析因洗脱剂以有机 溶剂为主且变化范围宽，具备分辨率高等特点，比较适合应用于各种小分子活 性物质的分离分析和鉴定。如小肽、寡聚核苜酸、黄酮类化合物等。24、结合疏水作用层析中几个层析条件优化实例说明利用疏水作用层析分离混 合物 时，应如何优化操作条件？优化目标：目标分子达所需纯度的基础上，获 得尽可能高的回收率，同

8、时力求缩短分离所需时间、降低分离成本。HIC中， 层析条件包括流动相A,流动相B,洗脱 方式，层析柱的柱长，流速，温度等。 流动相A与流动相B:流动相A的缓冲液的种类、pH ,盐的种类和浓度的选择: 缓冲液种类据所需的pH选择，注意目标物的稳定性，浓度一般在 0. OrO. 05mol/L；不同盐类对疏水作用的强度有影响，层析中的选择性也不尽 相同；盐浓度也随目标分子的疏水性而异，（NH4）2S04常用0. 7521noi/L, NaCl 为14moi/L。流动相B为不含盐的缓冲液，缓冲液与流动相A一致。洗脱的 方式：（1）采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）；（2）通过往 流动 相中添

9、加有机溶剂，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱（溶剂中稳定性良好的物质）；（3）往流动相中添加去污剂等，去污剂本身能 与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来（分离膜蛋白）。 温度升高会增加疏水作用，但注意蛋白质等生物大分子在较高温度下会变性。对 特定的分离，操作温度需保持恒定，才能确保层析结果具良好的重复性。第五章电泳技术1、简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的主要方法和特点并说明影响聚合的主要因素。 原料：丙烯酰胺Acr,甲叉双丙烯酰胺Bis。（1）化学聚合法：以过硫酸镂（AP） 为催化剂；以N, N, NL 2 -四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在碱性条件 下TE

10、MED催化AP生成硫酸自由基，接着硫酸自由基的氧原子激活Acr单体, 并形成单体长链，Bis将单体长链连成网状结构。增加AP和TEMED的浓度可 加速聚合；碱性条件下胶易聚合，而酸性条件下由于缺少TEMED的游离碱，难 以聚合，这时可用AgN03作增速剂；低温、氧分子及杂质会阻碍凝胶的聚合。 此法制备的胶孔径小且重复性好。（2）光聚合法：以核黄素作催化剂，TEMED为 增速剂，在光照及少量氧的条件下，黄素被氧化成有自由基的黄素环而引发聚 合。此法制备的凝胶孔径大且不稳 定，但用此法进行酸性凝胶的聚合效果比较 好。影响聚合的因素：（1）02会淬灭自由基，所以需脱气；（2）需高pH保证 加速剂能形

11、成自由基；（3）温度。温度升高，聚合速度加快。温度降低，聚合 速度减慢；（4）避免不纯物的影响：有机玻璃、赤血盐（铁氟化钾）等会造成 无法聚合。2、不*续电泳系统一般由哪几部分组成？电泳分离中的浓缩效应、电荷效应 和分子筛效应的原理是什么？不连续电泳系统主要由样品胶、分离胶和浓缩胶 组成。浓缩效应原理：电泳时，C1-很快迁移，后面形成低电导区，使Gly、Pr 的离子 加速。当稳定建立后，在快离子和慢离子之间形成一个迅速移动的界面， Pr就聚集 在这个移动的界面附近，被浓缩成一个个狭小的中间层。电荷效应 原理：各种蛋白质分子有效电荷不同，在电场中受力不同，迁移率不同，Pr以 一定顺序迁移。生物分

12、离原理与技术- 8 -分子筛效应原理：均一电压pH下， 分子量和构象不同Pr通过一定孔径的分离胶受阻力和阻滞不同，表现出不同 的迁移率，即所谓分子筛效应。3、等电聚焦IEF的主要原理是什么？为什么等电聚焦过程一般都采用高电压、 恒功 率方式？ IEF主要原理：依据蛋白质分子pl不同，在一个连续稳定的线 性pH梯度中电泳对蛋白质进行分离和分析的技术。IEF具有聚焦效应（浓缩效 应），是目前一向电泳中分辨率最高的技术，可以达到O.OlpH乃至O.OOlpH单 位。在pH梯度中，蛋白质 处于其非pl时，由于带净电荷，向异性电极方向迁 移，即向其等电点方向迁移，一旦抵达其等电点位置，因净电荷为0而停止

13、迁 移，在其pl位置聚焦成一条窄带。高电压、恒功率的原因：IEF 一般采用高 电压（上限可至2000V）,以提高分辨 率。等电聚焦电泳中通常采用恒功率方式。 随样品迁移，电流会越来越小，功率是电压和电流的乘积，为加快分离，提高 分辨率，电压应是越高越好，但应避免烧胶。4、请比较Native PAGE与SDS-PAGE在原理和应用上的主要差别。原理应 用Native PAGE 1、基于蛋白质的电荷密度，即在恒定的缓冲系统中不同蛋白 质同性静电荷的差异;2、基于分子筛效应，即与蛋白质的分子大小和形状有关。 可以研究蛋白质的特性，如电荷、分子量、等电点乃至构象，并可以用于蛋白 质纯度鉴定。SDS-P

14、AGE 1, SDS是一种阴离子洗涤剂，能破坏蛋白质分子内和 分子间的氢键及疏水作用，使分子失去折叠，导致蛋白质构象发生改变。2、端 基乙醇等还原剂可以打开蛋白质分子内的二硫键，使其分解为亚基。3、SDS与 蛋白质结合，掩盖蛋白质分子间原有的电荷差异，使SDS-蛋白质分子复合物 带有相同的电荷量。因此在SDS-PAGE中蛋白质仅存在分子或亚基大小的差别。4、除了基于分子筛效应外，还基于其对样品的浓缩效应。常用于测定蛋白质 亚基的分子量及鉴定纯度。5、归纳凝胶电泳技术中检测条带的主要染色方法和特点，分析条带变形的主要 原因。（1）考马斯亮蓝染色：分为R-250和G-250,常用R-250；染色后

15、颜色 深浅与蛋白质含量呈线性关系，在一定pH值时，蛋白质-染料复合物又可解聚; 染色灵敏度达0。20。5u带（2）银染：先固定，蛋白带上的AgN03被还原 成金属Ag而沉积在蛋白带上而显色；显色有化学显色和光显色；灵敏度达 2ng/带；（3）其他染色方法：荧光染料法、苯胺黑、氨基黑、丽春红S、快绿 ICF,蛋白质与2, 4-DNFB的 反应等等。电泳过程中的不正常现象和对策：（1） “微笑”现象常在厚胶和垂直电泳中出现，原因是凝胶中间冷却不均匀;“皱眉” 原因（垂直电泳中可能出现）可能是电泳装置不合适，靠近隔板处凝胶未聚合 完全或凝胶底部有气泡。（2） “脱尾”现象：原因：样品溶解不佳，凝胶浓

16、度过 高；对策：加样前离心，选合适缓冲液，加增溶辅助试剂，降低凝胶浓度（3） “纹理”现象：原因：常常是样品中不溶颗粒造成的；对策：增加 溶解度，离 心除不溶颗粒。6、梯度电泳和SDS-PAGE都是按分子量大小不同进行分离的电泳方法，比较这 两种方法在原理和应用上的主要差异，并佐以实例加以证明。原理应用梯度 电泳利用梯度混合器使胶的孔径呈梯度变化，分子量不同的蛋白质所能到达 的前沿不同。分离范围大约在5200万MW植物材料：加纤维 素酶、半纤维素酶和果胶酶等。发展方向：（1）多种破碎方 法相结合。（2）与上游过程相结合。（3）与下游过程相结合。2、简述盐析与有机溶剂沉淀方法的原理、主要应用范围

17、及分级范围的选择依据, 比较这两种方法的优缺点和差异。盐析。原理：“盐溶”低浓度中性盐离子对 蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使 其溶解度增大。“盐析”中性盐浓度增加至一定值时，水分子定向排列，活度大 大减少，蛋白质表面电荷被中和，水膜被破坏，从而聚集沉淀。盐析范围的确 定:可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得（从回收率和纯度考虑）。盐 析的优点：成本低，不需要特别昂贵的设备；操作简单，安全；不会引起蛋白 质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。缺点:效果不理想， 通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化。有机溶剂沉淀。原理： 使溶液

18、的介电常数大大降低，从而增加带电粒子自身之间的作用力，易聚集沉 淀。争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子，破坏水化层，使分子易碰聚产生沉 淀。优点：分辨能力比盐析高，即一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的 有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱盐，过滤比较度范围内沉析；沉析不用 脱盐，过滤比较容易。缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活， 操作需在低温下进行。3、从植物或动物材料中提取酶类，一般预处理过程中影响酶收率的主要原因是 什么？如何解决？组织中所存在的酚类化合物使植物中提取生物大分子的过程 变得复杂。组织被破坏时，蛋白质等大分子和酚类处混合接触状态，很易发生 反应。酚类氧化产物酶类

19、生物分离原理与技术- 2-和单宁酸类会继续和蛋白 质反应，使目的蛋白失去活性。为此去除酚类化合物或避免反应是必须进行的 步骤。在提取酶、核酸、多糖等生物大分子时，其他大分子的存在会对提取产 生干扰，需要有效手段去除。预处理需要注意。植物：（1）温度尽可能低。（2） 提取液的量要保证“充分浸入”。（3）加入足量酚类吸附剂。（4）加入足量氧化酶 抑制剂。（5）搅拌转速要恰当。（6）pH要控制在合适范围，一般5.57。动物：（1） 匀浆化前的预处理（冷冻）。（2）提取物缓冲 液的选择（中性）。（3）蛋白酶抑制 剂的添加。（4）保护剂的添加（8-疏基乙醇、EDTA、辅酶等）。（5）提取液的 澄清（高速

20、离心、沉淀、吸附等）。4、请说明微生物发酵液的预处理过程的主要目标是什么？有哪些主要方法及 特点。（1）发酵液杂质的去除。发酵成分复杂，时提取影响最大的是高价无机 离子和杂蛋白，主要影响后期离子交换、萃取、膜过滤等。无机离子的去除： 钙离子：加入草酸形成沉淀，酸化发酵液，草酸钙还能促使蛋白质凝固；镁离 子:加入三聚磷酸钠可与之形成可溶性络合物，可不再干扰离子交换；铁离子： 加黄血盐使其形成普鲁土蓝沉淀。可溶性蛋白质的去除:盐析、等电点沉淀、 加热法、有机溶剂沉淀法、吸附法、其它沉淀法。有色物质的去除：常用脱 色方法为吸附法，如活性炭吸附、树脂吸附等。（2）改善发酵液的处理性能。 细菌及某些放线

21、菌菌体细小，发酵液粘度大，往往不能直接过滤，直接用离心 法实现，则能耗很大，应用微滤的方法，又容易产生膜堵塞。需要通过一些简 单手段降低发酵液粘度，改善处理性能。方法：降低发酵液的粘度、加热法和 加水稀释法、调节pH值：因pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性 质，通过调节pH值可以改善过滤特性。5、请说明提取液的澄清方法有哪些，原理及选择依据。方法：（1）粒子聚结 （增大d）, 25% （NH4）2S04处理，适用动物细胞。（2）降低 提取液粘度，可用 水解随法或选择性沉淀法除去。适于微生物细胞。（3）其他方法：80%硫钺或 55%丙酮，使Pr沉淀而类树胶不沉淀；吸附法；改善破碎方法。

22、6、何谓透析盐析、何谓反抽提法？它们的特点和选择依据是什么？透析盐析： 将Pr溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，袋 中盐浓度连续性变化，使Pr沉淀。特点:避免共沉淀，分离效果好，处理量小。 反抽提法:将包括要分离的Pr在内的多种Pr 一起沉淀出来，然后选择适当的递 减浓度的硫酸铉来抽提沉淀物。特点:得率较高。第三章膜分离技术1、何谓“浓度极化”和“凝胶极化”现象，怎样避免膜过滤中的“浓度极化” 现象？ （1）浓度极化:在膜分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面上， 不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近浓度升高。这种在膜 表面附近浓度高于主体浓度的现象

23、称为浓度极化或浓差极化。它是一个可逆过 程，只有在膜过程运行中产生存在，停止运行，浓差极化逐渐消失。克服极化 的主要措施有：振动、搅拌、错流、切流等技术。凝胶极化:膜表面附近浓度 升高，增大了膜两侧的渗透压差，使有效压差减小，透过通量降低。当膜表面 附近的浓度超过溶质的溶解度时，溶质会析出，形成凝胶层。当分离含有菌体、 细胞或其他固形成分的料液时，也会在膜表面形成凝胶层。这种现象称为凝胶 极化。2、简述微滤膜的主要种类，特点和主要分离机理。微滤膜的分类：（1）有机微 滤膜:具有韧性，适应性强，制备简单，易成形，工艺较 成熟。常用聚乙烯、聚 偏氟乙烯和聚四氟乙烯等聚烯烧类聚合物组成。（2）无机微

24、滤膜:无机陶瓷膜具 备化学稳定性好、机械强度大、抗污染能力强、耐高温、孔径分布窄、可高压 反冲洗、再生能力强、分离效率高、不易老化等优点。（3）复合微滤膜:充分利 用了有机与无机微滤膜的各自优点：将一层微滤膜的薄膜和常规过滤介质利 用层压技术复合在一起；通过不同的工艺手段实现有机与无机的黏合改性； 将微 滤膜技术与生物处理法相结合的新型复合式膜生物反应器。分离机理:膜 的过滤行为与膜及过滤对象的物理化学特性有关，对微滤而言，其分离机理主 要是筛分截留。液固分离主要作用：（1）筛分，膜将尺寸大于孔径的颗粒截留。 吸附，膜将尺寸小于孔径的颗粒吸附截留。（3）架桥，固体颗粒在膜微孔入口 处因架桥而被

25、截留。（4）网络，截留发生在膜内部，因膜孔的曲折而形成。（5） 静电，分离悬浮液含带电颗粒时可采用带相反电荷的微滤膜。用孔径比待分离 的颗粒尺寸大许多的微滤膜，不仅可达到较好的分离效果，还可获较高通最。3、膜选择和使用时考虑的主要参数是什么？影响流率的主要因素是什么？ （1） 截留分子量:指截流率达90%以上的最小被截留物质的分子量。（以球形分子测） 一般选用的膜的额定截留值应稍低于所分离或浓缩的溶质分子量。（2）流动速率： 指在一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量。（ml/cm 2 o min）o其它还有 操作温 度、化学耐受性、膜的吸附性能、膜的无菌处理等等。影响流率的因素： （1）溶质

26、的分子性质，比重大的纤维分子扩散性差，比重较小的球形分子易扩散。（2）溶质浓度：一定压力下，稀比浓流率高。（3）压力：不同溶 质应选择不同 的操作压力。（4）搅拌：加快扩散，减少浓度极化，提高流率；对切力敏感的 大分子（酶、核酸）须控制搅拌速度。（5）温度：升温能提高流率（不同溶质 生 物分离原理与技术- 3 -区别对待）。（6）其它：如溶液pH、离子强度及溶剂 因素等对流率均有影响。4、从原理上比较超滤和纳滤两种膜过滤技术，简要说明它们的主要差别。超 滤：以特殊超滤膜为分离介质，以膜两侧的压差为推动力，将不同分子量物质选 择性分离。最小截留分子量500道尔顿。用途：大分子物质脱盐和浓缩； 小

27、分子物质纯化；大分子物质分级分离；生化制剂或其它制剂去热原处理 纳滤技术。纳漉是介于超滤与反渗透之间的膜分离技术，其截留分子量在 200-1000的范围内，孔径为几纳米。截留小分子有机物同时透析出盐，集浓缩 与透析一体；在保证一定膜通量的情况下，纳滤所需压力比反渗透低的多，可 节约动力。5、超滤的工作模式有哪几种，各种工作模式的主要特点是什么。超滤的工作 模式有：（1）浓缩:在浓缩悬浮粒子或大分子过程中，产物被膜系统截留在料液罐 中。（2）透析：在悬浮粒子或者大分子透析过滤中产物被膜截留住，低分子量 溶质盐、蔗糖、醉则通过膜。（3）纯化:采用这一工作模式纯化溶剂和低分子量 溶质，他们被回收在透

28、过液流中，可是在截留的物质中也可能同样含有感兴趣 的产物。第四章层析分离技术1、何谓层析的固定相、流动相、迁移率、分辨率？固定相：是层析的基质， 可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固 定在滤纸、硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的 吸附，溶解，交换等作用，对层析的效果起关键的作用。流动相：指在层析过 程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体 等。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的 重要影响因素之一。迁移率Rf：指在一定条件下，在相同的时间内某一组分在 固定相移动的距离与流动相本身

29、移动的距离之比值。迁移率的差异程度往往是 决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。分辨率Rs：是用来描述两 种物质之间分离效果的好坏参数，其定义是两个洗脱峰峰顶对映的洗脱体积之 差比上两峰在基线上峰宽的和的平均值。2、简述吸附剂的主要类型和特点。常用吸附剂按其化学结构可分两类：（1）有 机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大 孔吸附树脂、聚酰胺等；（2）无机吸附剂， 如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅藻土、羟 基磷灰石等。常用吸附剂简介：硅胶： 是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放 弱酸性的氢离子，遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。 应用于葩类、固醇

30、、生物碱、酸性化合物、磷脂、脂肪、氨基酸等的吸附分离。 氧化铝：对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类颇为理想；用稀硝酸或稀盐 酸处理氧化铝，不仅可中和含有的碱性杂质，并可使颗粒表面带有阴离子，具离 子交换剂的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性。氧化铝；经 不同的处理还可得到中性氧化铝或碱性氧化铝，它们分别适用于不同物质的分 离。活性炭：是使用较多的一种非极性吸附剂。一般选用颗粒活性炭，主要用 于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些成。活性炭的吸附作用，在水溶液 中最强，在有 机溶剂中则较低。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。羟 基磷灰石：羟基磷灰石具有多孔结构。HA的吸附机理

31、：HA机理的主要观点是： HA的Ca 2+和生物分子表面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重要作 用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的正电荷基团的结合，则起次要作用。大 孔吸附树脂：特点：大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选不同的原 料和合成条件而改变;借助范德华力吸附有机物质，不受无机盐干扰;解吸容易、 机械强度好、可反复使用。3、简要阐述影响吸附层析效果的主要因素。吸附层析的分离效果，决定于吸 附剂、溶剂、被分离化合物的性质及吸附条件等因素。吸附剂的性质：吸附剂 的比表面积、颗粒度、孔径、极性对吸附的影响很大。比表面积越大，空隙度 越高，吸附容量越大；而颗粒度越小，吸附速度就越

32、快。一般要吸附相对分子 量大的，要选择孔径大的吸附剂；吸附相对分子量小的则选择比表面积高及孔 径小的。洗脱剂（溶剂）：极性吸附剂层析时，当被分离物质为弱极性物质， 般选用弱极性溶剂为洗脱剂；被分离物质为强极性成分，则须选用极性溶剂为 洗脱剂。而对非极性吸附剂，如活性炭，则正好与上述顺序相反。被分离物质 的性质：在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被 分离物质的结构与性质有关。吸附条件:温度：吸附一般是放热的，升高温度会 使吸附量降低；蛋白质或酶类的吸附却往往是吸热的，升高温度会使吸附量提 高,但需注意热稳定性。pH：溶液的pH往往会影响吸附剂或吸附物的解离情况， 进而影响

33、吸附量，一般需通过具体实验来确定。盐的浓度：影响比较复杂，对 不同物质不同，需要考察后确定。4、名词解释：（1）排阻极限；（2）分级范围；（3）死体积；（4）外水体积（V0）； 生物分离原理与技术-4 - （5）内水体积（Vi）； （6）常用的层析分离介质的名 称（如Sephadex G-75）； （7）交换容量和有效交换容量；（8）陶南效应。排 阻极限：是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻 极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被 最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝 胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分

34、离。分级范围：即能为凝胶阻滞并 且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。死体积：本意是指色谱 柱中未被固定相占据的空隙体积，也即色谱柱内流动相的体积外水体积：色谱 柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用V。表示。内 水体积:因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这 就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。交联葡聚糖凝胶（Sephadex）：骨架：葡聚糖（dextran ）；主链：a-1, 6-糖昔 键（约 95% ）； 分支：a-1, 3-糖苜键（约5%）；交联剂：环氧氯丙烷以酸键交联；控制葡聚 糖与交联剂比例可制造不同孔径凝胶

35、。G-X可表示型号，X从10-200, G- X, X=25、75、200 , X表示10g干胶的吸水量ml。交换容量：指离子交换剂能结 合溶液中可交换离子的能力，分为总交换容量和有效交换容量。有效（实际） 交换容量：指在一定的实验条件下，每克干介质或每毫升湿胶吸附某种蛋白质 的实际容量。陶南效应：离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。在阳IE表 面的微环境中，H +被吸引而oil -被排斥，交换剂表面pH比周围低1个 pH单位；而阴IE表面的微环境中，0H -被吸引而H +被排斥，交换剂表 面pH比周围高1个pH单位。5、凝胶过滤层析中Kd的意义是什么？为什么它一般在。和1之间，大于1和

36、小于0的反常情况可能是什么原因？怎样处理？ Kd分配系数二固定相溶质的 浓度/流动相溶质的浓度，A类分子只走外水体积，所以Kd=0;C类分子走所有 的外水体积和内水体积，Kd=（Ve-VO） /Vi,所以Kd大于0小于1。溶质洗脱 的异常 Kd （0,因装柱不好，发生沟流（短路）；Kd1,凝 胶对溶质分子 可能有吸附作用。6、分子量为1千和3千的一组分子，或分子量为8万和10万一组分子能 否在Sephadex G-75柱中分开？为什么？因为sephadeG-75的分离范围为 10000到50000所以两组分子都在分离范围之外，不能很好的分离。7、伴刀豆球蛋白、血纤维蛋白、香菇多糖的分子质量能否

37、一起用葡聚糖凝胶层 析柱测定？为什么？凝胶过滤层析，是根据凝胶颗粒具三维网状结构，可对大 小不同的分子流动产生不同的阻滞作用，但是以上三种大分子物质的结构不同， 这就会影响其在凝胶中的分配比。球状的蛋白要比血纤维的蛋白走的快，因此 分离的最后效果，不仅和分子量大小有关，而且和分子的形状有关，所以不能 直接用来测定三种的分子量大小。可以先将他们变性，使其有相类似的结构， 然后再测定。8、层析系统的分辨率主要取决于什么参数，何种最重要？以离子交换层析为例, 如果优化实验条件以提高分辨率？层析系统的分辨率主要取决于：选择性a, 效率n,和k，容量因子三个参数。选择性较为重要。容量因子k，乂称保留因

38、子，是层析分离中常用的组分保留值表示法，注意不要将其与离子交换剂的吸 附容量（mg样品/ml胶）相混淆。一般来说，容量因子H的取值与蛋白质在 固定相（离子交换剂）和流动相（缓冲液）中的分配性质、层析温度及固定相 和流动相的体积比有关，而与柱尺寸和流速无关。提高RS以达满意分离效果， 须满足以下条件当VR1二VR2时a =1,两峰完全重叠，分辨 率为0）, a的值越大，两峰相距越远，分辨率越高；（2）N尽可能大，理论塔板数越大， 柱效率越高，分辨率也越高；（3） - W0,若k, =0,无法实现分离，分辨率为 0,需选合适层析条件，使至少一种蛋白质在离子交换剂上发生吸附，就能满 足k W0,增加

39、k的值将提高分辨率RS,有利于分离。9、装填制备合格的层析柱主要应注意哪几点？如何检验？如何保养？ （1） 用缓冲液将层析柱底部死空间内的空气排空。（2）预处理的离子交换剂 放置在 烧杯中，使得交换剂：上清液（v/v） =3： 1,轻微搅拌混匀。（3）利用玻棒引流 尽可能一次性将介质倾入层析柱，注意液体应沿着柱内壁流下。（4）当需要往柱 内补加交换剂时，应将沉降表面轻轻搅起，然后再次倾入，防止两次倾注时产 生界面。（5）对装柱情况进行检查。-（1）柱尺寸（H/D）;连续梯度：H/D4 5；阶段式梯度：H/D12； （2）充填；（3）平衡：23vt始缓平衡，测定电导、 pH是否平衡完毕：目的：床

40、体积稳定流出液pH、I 一致样品；测完后清洗。 10、离子交换剂由哪几部分组成？何为阳离子和阴离子交换剂？离子交换剂由 水不溶性基质（支持物）和共价结合在基质上的带电功能基团组生物分离原理 与技术- 5 -成，带电功能基团上还结合有可移动的与功能基团带相反电荷的 平衡离子。离子交换剂很大程度上决定着分离过程的分辨率，分离的规模和成 本。具有阳离子交换功能基因的离子交换剂称阳离子交换剂；具有阴离子交换 功能基因的离子交换剂称阴离子交换剂。11弱酸性和弱碱性的离子交换剂分别适宜在哪些pH范围内使用？为什么？ 弱酸性和弱碱性的离子交换剂即对应弱阳离子交换剂和弱阴离子交换剂。弱酸 性阳离子交换剂在pH

41、值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱； 弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减 弱。前者因为其功能基团解离范围在酸性范围，所以只能在低于7的pH范围 使用，一般3-5之间使用，后者往往在6-9范围，具体范围与所以选择的功能 基团的解离情况有关。12、已知目标蛋白是分子量约200, 000,等电点为6. 8, pH稳定范围在4. 07. 5 的酶分子，如何选择离子交换剂并设定层析条件？因目标蛋白的pH稳定范围 在4.07. 5之间，而且pl为6. 8,故应选择p*6.8。pH608范围内的宽度 大，一般选择pH为5. 8或5. 5左右（考虑陶南效应）。

42、同时应 选择阴离子交换 剂，选择强阴离子（如磷酸基团）。CM基团在pH 6左右带负电荷。目标蛋白分 子量约为200, 000,因此选择G-50或者G-25均不行。故应选择琼脂糖或者 纤维素。基于强酸基团应选择Sepharose离子交换剂，弱阳离子交换剂 CM（pH3. 5- 6）,流动相的 pH5,流速 Icm/min。13、在对某样品进行离子交换层析分离后得到如下层析图谱，层析采用了 NaCl 浓度梯度洗脱，NaCl终浓度为Imol/L,如何根据此层析结果优化层析条件？（*号标记的是目标蛋白）此层析结果已经很好，目标蛋白已经和杂质很好的分离开。并且目标蛋白洗脱 位置也已经很合适。如果想要进一

43、步优化：（1）通过改变梯度的形状和斜率来 提高分辨率，也可以根据目的物被洗脱的盐浓度确定进行 阶段洗脱的条件。（2） 梯度的高度和斜率也影响着分离的速度和效果。（3）适当的降低洗脱过程的流 速可以提高色谱的分辨率。14、试比较亲和层析的特异性洗脱和非特异性洗脱的优缺点。特异性洗脱非特 异性洗脱优点1、一般在中性条件下进行，比较温和，不会导致蛋白质变性。2、特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。 洗脱方式简单。缺点价格可能会比较高，且洗脱下来的蛋白质可能很难与洗 脱液分离，这时可用凝胶过滤色谱进行脱盐解吸或者透 析分离。1、但洗脱体 积一般比较大，得到的待分离物质浓度

44、较低。2、对于与配体亲和力很强的分 离物质，往往要采用很强洗脱条件才能进行分离，但可能会使待分离物质发生 不可逆变性。15、亲和层析吸附剂制备时，为何常引入“连接臂”？当配体比较小，而待分 离生物分子较大时，由于载体表面的临近效应会限制配体与生物分子结合，这 是通过连接臂连接配体和载体，就不会阻止配体与生物分子结合。连接臂的作 用就是消除配体的空间位阻。16、简述亲和层析吸附剂制备的主要方法和步骤。要求：L与基质结合， 对L-S结合无干扰；L为小分子有的需“手臂”，使L-S结合更有效；非 专一吸附不大，以免吸附杂质；L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。 偶联用Gel的选择需考虑：L上可供偶联

45、的基团；“手臂”；L的稳定 pllo由CNBr活化型Sepo 4B制备：商品名：CNBr-Sepharose0冻干粉-*溶 胀洗涤（溶解L） 一混合反应一掩蔽一洗去L （未结合）一成品。溶胀和洗 涤：用lmol/L 1IC1溶胀洗涤除细碎粒子。偶联条件。注意：前处理、偶联 密度、缓冲液种类及pH。掩蔽。偶联后有部分氟酸酯未偶联上L,常利用含 -NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其掩蔽。洗去未结合L：用高-低交叉 pH来洗（45次）。17、亲和层析的特殊类型有哪些？简述它们的基本原理和应用范围。（1）凝 集素亲和层析：凝集素是一类来自于霉菌、植物和动物的蛋白质，能可逆地、选 择性地同特定的

46、糖基结合。不同的凝集素结合不同的糖分子。用于分离含糖基的 化合物，如多糖、糖蛋白、糖脂、细胞内颗粒、细胞等。（2）免疫亲和层析： 以抗原抗体中的一方作为固定相，对另一方吸附分离，是目前最具选择性和最 有效的纯化方法之一，往往一步就能达到纯化目的。用专一性的抗体（抗原） 作为配体时，亲和吸附剂一般需自己合成，成本较高。抗原-抗体间结合比生物 分离原理与技术-6 -较牢固，有时需用到较强烈的洗脱条件。它能区分非常 相近的抗原或抗体，并且只需一步就能从大量的复杂蛋白质中分离出极少量的 的目的抗原或抗体。（3）染料配体亲和层析：蓝色染料Cibacron blue F3GA 在结构上与NAD +和NAD

47、P +很相似，用于纯化NAD +、NADP +依赖性酶，如 各种激酶、磷酸酶、脱氢酸、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等。红色染料 Procion Red HE3B用于纯化NADP+依赖性酶，如某些脱氢酶，以及其他非相关 蛋白质，如干扰素、抑制蛋白、酸肽酶G、血纤 蛋白溶酶原等，结合不仅依赖 于特定基团，还依赖于离子键或疏水相互作用。（4）金属整合亲和层析：这种 方法基于蛋白质分子表面的组氨酸咪嘎基、半胱氨酸疏基和色氨酸呻味环能与 铜离子、锌离子、银离子之间形成稳定的螯合物而进行分离的。因此是分离许 多蛋白质的重要工具。金属螯合亲和层析目前还只是一种实验室规模的蛋白质 纯化技术。* （5）多肽亲

48、和层析：多肽是亲和层析纯化大分子更有效的配基。 因为它只含有一些 氨基酸，所以即使脱落进入产物中也不会产生免疫反应。它 们能够在GMP条件下进行大规模的无菌生产。* （6）共价层析：利用疏基之 间二硫键相互作用，对含筑基的蛋白质进行分离纯化。* （7）有机染料亲和色 谱：有机染料如意酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。一些需核甘酸 类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力。18、简要说明反相层析的原理,并解释何谓疏溶剂理论（solvophobic theory）o 反相层析的原理.：基于溶质分子和固定相中键合在基质上的疏水性配基间的疏 水相互作用。疏溶剂理论：假设反相层析介质是表面均匀

49、密集的覆盖着非极性 配基的颗粒，溶质分子由于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定 相的非极性配基上，除此之外溶质与固定相之间不存在其他任何相互作用。19、何谓“亲硅醇基效应” （silanophilic interaction） ?如何解决其对 反相层析的影响？亲硅醇基效应：一定条件下硅胶表面残余的硅醇基能与溶质 发生相互作用，包 括：静电作用和氢键作用，从而对溶质的保留行为起决定作 用。亲硅醇基效应常导致溶质保留值重复性差，洗脱峰脱尾等不良层析行为， 控制流动相pH在酸性范围内可以一直硅醇基的解离，从而避免出现静电作用。 而较好的反相层析介质合成技术使得硅胶表面均匀覆盖非极性配基，同时对残 余硅醇基进行了屏蔽，基本排除亲硅醇基效应的影响。新型反相层析介质聚苯 乙烯等高分子聚合材料的开发可根本消除亲硅醇基效应的影响。20、试分析和说明反相层析过程中主要可优化的条件。首次层析时通常采用很 宽的线性梯度洗脱以确定目标分子的洗脱条件,常用梯 度：1