HBV、HCV检测规程.docx

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1、乙型肝炎病毒核酸定量检测1 原理本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针配以 PCR 反响液、耐热DNA 聚合酶TAQ 酶、核苷酸单体DNTPS等成分，用 PCR 体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA。2 标本种类及收集要求2.1 标本采集2.1.1 标本种类：血清或血浆。2.1.2 标本要求：血清用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血 2ml，注入无菌的枯燥生化管，使用水平离心机， 3000rpm 离心 10min;吸取上层血清，转移至1.5ML 进口灭菌管。血浆用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入含 EDTA乙二胺四乙酸二钠抗凝剂管，马上轻轻颠倒玻璃管混合

2、 510 次， 使抗凝剂与静脉血充分混匀，3000rpm 离心 10min;吸取上层血浆，转移至 1.5ML 进口灭菌管2.2 标本储存：标本可马上用于测试，也可以保存与20待测，保存期为 6 个月。2.3 标本运输：密封，室温运输。2.4 标本拒收标准：污染、标本量缺乏、严峻溶血或脂血标本不宜作此项检测。3 试剂3.1 试剂名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒PCR-荧光探针法3.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份。3.3 包装规格：20 人份/盒3.4 试剂盒组成DNA 浓缩液，DNA 提取液，PCR 反响管，HBV 临界阳性质控品，HBV 强阳性质控品，阴性质控品，HBV 阳性定量参

3、考品1.0104IU/ml、1.0105 IU/ml、3.5 试剂储存条件及有效期：-20避光保存，有效期 6 个月。4 仪器设备4.1 仪器名称：生物安全柜(级)、高速冷冻离心机、荧光定量PCR 仪、恒温金属浴。4.2 仪器厂家：上海培清、美国NUAIR 公司、美国eppendorf、美国ABI 生物技术公司、广州达安基因。4.3 仪器型号：ABI7300、DA7600。5 操作步骤5.1 DNA 提取：5.1.1 标本处理血清和血浆标本处理一样-取 100ul 血清参与等量 DNA 浓缩液，振荡器振荡混匀 5sec；12，000rpm 离心 10min；去上清，沉淀中参与 30ul DNA

4、提取液，振荡器猛烈振荡混匀 5-10sec，瞬时离心数秒，100恒温处理 101min； 12，000rpm 离心 5min，备用。5.1.2 阴性质控品处理-取出阴性质控品，8，000rpm 离心数秒，吸 50 ul 至 0.5ml 灭菌离心管中，参与 50 ul DNA 提取液充分混匀，100恒温处理 101min： 12，000rpm 离心 5min，备用。5.1.3 HBV 临界阳性质控品处理同阴性质控品5.1.4 HBV 强阳性质控品处理同阴性质控品5.1.5 HBV 阳性定量参考品处理：振荡摇匀，8，000rpm 离心数秒，备用。5.2 PCR 扩增5.2.1 加样：取 PCR 反

5、响管假设干，分别参与处理后的样品包括标本、阴性质控品、临界阳性质控品上清液 2 ul 或直接参与阳性定量参考品 2UL，8，000rpm 离心数秒， 放入仪器样品槽。5.2.2 扩增：翻开 instrument 窗口设置循环条件：932min9345sec5560sec10 个循环，9330sec5545sec30 个循环，保存文件，运行。6 结果推断与分析6.1 假设增长曲线不呈 S 型曲线或 ct 值=30，则判样品的 HBV DNA 总含量小于检测下限。6.2 假设增长曲线呈 S 型曲线且 ct 值30，则按以下方法推断：假设定量数值在线性范围内：1.00E+003 C1.00E+008

6、，则样品 HBV DNA 总含量为 C IU/ml；假设定量数值在线性范围外：有两种状况:6.2.1 C1.00E+008, 则样品 HBV DNA 总含量1.0108 IU/ml.假设需要准确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。6.2.2 C1.00E+003, 则样品的 HBV DNA 总量为 C IU/ml，定量数值供参考。7 质量把握依据试验结果表中显示的 Ct 值来推断试验是否成功：如试剂质量完好并操作正确，阳性比照顾表现为阳性结果，阴性比照顾无 Ct 值，否则试验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。定量阳性比照顾能形成标准曲线，相关系数在 0.99 以上，则

7、证明试验成功；8 参考范围：1000IU/ml。9 操作性能：依据临床考核，本试剂盒的检测下限为 5.0102 IU/ml，线性范围为 1.0103-1.0108IU/ml。10 临床意义：PCR 定量结果用于与血清基因学结果的综合评价及观看抗病毒药物对慢性乙型肝炎治疗效果，指导药物用量；进展献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断；跟踪观测肝移植术后的 HBV 复发状况，及进展对阻断母婴传播的监测。11 方法局限性: 对于结果阳性的报告，只说明该样本中有病毒的遗传物质DNA 存在，并不说明有活病毒存在;虽然本试剂盒检测特异性、灵敏度均高，但检测结果为阴性的并不能排解样本含有病毒，只能说明样本中含

8、有的病毒浓度低于本试剂盒的检测灵敏度。12 留意事项12.1 开头检测前请认真阅读本说明书全文。12.2 假设血清标本消灭溶血现象，则认为标本不合格，建议重采集标本。12.3 每次试验前、后依据用 1次氯酸钠、蒸馏水、75酒精的挨次进展消毒清洁擦拭移液器、操作台。并用紫外消毒灯照耀工作台面。12.4 在试剂预备和样本处理时应使用防污染罩。操作戴口罩、一次性手套。12.5 在试验中使用带滤芯的移液器头并且所用器具均应经过灭菌处理。12.6 每次试验应设置阴阳性比照品；在有效期内使用试剂盒。12.7 试剂盒组成中离心管使用前应充分溶化并混匀。12.8 DNA 提取液使用前，需充分溶化后混匀。12.

9、9 反响管中加人 DNA 模板后，应尽快完成荧光测定，开头 PCR 反响。12.10 配制反响体系过程中假设需标记，请在试管架或离心管架上标记，不要直接标记在离心管上。12.11 检测后遗留的血清样本或痰样本应马上盖好盖子置于样品处理区的垃圾桶内；检测中全部用过的手套应扔在本工作区的垃圾桶内，不得带出该工作区。12.12 各工作区垃圾桶内的垃圾均作为有生物传染性的危急品每天由专人处理。13 参考文献卫生部微生物生物医学试验室生物安全通用准则和医疗废物治理条例。丙型肝炎病毒核酸定量检测操作规程1 原理本试剂盒用一对丙型肝炎病毒特异性引物和一条丙型肝炎病毒特异性荧光探针， 配以 PCR 反响液、耐

10、热DNA 聚合酶Taq 酶、核苷酸单体dNTPs等成分， 用 PCR 体外扩增法，通过荧光信号的变化，经过逆转录检测丙型肝炎病毒 RNA。2 标本种类及收集要求2.1 标本采集2.1.1 标本种类：血清或血浆。2.1.2 标本要求：血清用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血 2ml，注入无菌的枯燥生化管，使用水平离心机，3000RPM 离心 10min;吸取上层血清，转移至1.5ML 进口灭菌管。血浆用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入含 EDTA乙二胺四乙酸二钠抗凝剂管，马上轻轻颠倒玻璃管混合 510 次， 使抗凝剂与静脉血充分混匀，3000RPM 离心 10min;吸取上层血浆，转移

11、至 1.5ML进口灭菌管2.2 标本储存：标本可马上用于测试，也可以保存与20待测，保存期为 6 个月。2.3 标本运输：密封，室温运输。2.4 标本拒收标准：污染、标本量缺乏、严峻溶血或脂血标本不宜作此项检测。3 试剂3.1 试剂名称：丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒PCR-荧光探针法3.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份。3.3 包装规格：10 人份/盒3.4 试剂盒组成DNA 浓缩液，RNA 提取液 A，RNA 提取液 B,HCV PCR 反响液 I,逆转录酶，DEPC H2O ,PCR 反响管，HCV 临界阳性质控品，HCV 强阳性质控品，阴性质控品，HCV 阳性定量参考品1.010

12、5IU/ml、1.0106IU/ml、1.0107 IU/ml、1.0108 IU/ml。3.5 试剂储存条件及有效期：-20避光保存，有效期 6 个月。4 仪器设备4.1 仪器名称：生物安全柜(级)、高速冷冻离心机、荧光定量PCR 仪、恒温金属浴。4.2 仪器厂家：上海培清、美国NUAIR 公司、美国eppendorf、美国ABI 生物技术公司、广州达安基因。4.3 仪器型号：ABI7300、DA7600。5 操作步骤5.1 RNA 提取5.1.1 标本及质控品处理5.1.1.1 取灭菌的 1.5mlEP 离心管参与 10ul RNA 提取液 A充分混匀后吸取，加100 ul 血清标本吸取血

13、清时留意勿带入红细胞或阴阳性质控品，再参与 200 ul RNA 提取液 B RNA 提取液 B 溶解混匀后使用，振荡混匀，室温放置 5min， 8.000rpm 离心 1min，留神吸去上清留意吸头不要遇到沉淀；5.1.1.2 加 200ul RNA 提取液 B，充分混匀用移液器吹打，8.000rpm 离心 1min，留神吸去上清；5.1.1.3 加预冷的 75%乙醇用无水乙醇和试剂盒供给的 DEPC H2O 配置450 ul充分混匀，8.000rpm 离心 1min，留神吸去上清；5.1.1.4 加预冷的 75%乙醇 450 ul 充分混匀，8.000rpm 离心 1min，留神吸去上清；

14、5.1.1.5 翻开管盖，70枯燥 10min75%乙醇要全部挥发完毕，盖上管盖待用于逆转录。5.1.1.6 HCV 阳性定量参考品处理：8，000rpm 离心数 sec，备用5.2 逆转录5.2.1 向枯燥后的沉淀管参与 18ul PCR 反响液 I 打匀，再加逆转录酶系 2ul，振荡混匀：37放置 45min，95加热 3min。8000rpm 离心 1min，待用逆转录成 cDNA 后，建议马上进展下一步试验，否则请转移上清至灭菌离心管，保存于-20待用。5.3 PCR 扩增5.3.1 加样：取 PCR 反响管假设干，参与逆转录后的样品包括标本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品上

15、清液 5ul，或直接参与阳性定量参考品5ul，8000rpm 离心数 sec，放入仪器样品槽。5.3.2 翻开 instrument 窗口设置循环条件：932min9345sec5560sec10 个循环，9330sec5545sec30 个循环6 结果推断与分析6.1 假设增长曲线不呈 S 型曲线或 ct 值=30 ，则判样品的 HCV RNA 总含量小于检测极限。6.2 假设增长曲线呈 S 型曲线或 ct 值30，则按以下方法推断 ： 假设样品的 C1.00E+003,则判样品 HCV DNA 总含量1.0103 Iu/ml假设样品的 1.000E+003C1.000E+08，则判样品 H

16、CV DNA 总含量=C IU/ML 假设样品的 C1.000E+08 ，则判样品 HCV DNA 总含量1.0108 IU/ml。假设需要准确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内在检测。7 质量把握阴性质控品：增长的曲线不呈 S 型曲线或 ct 值=30；阳性质控品：增长曲线呈 S 型曲线。且强阳性质控品定量参考值在 5.0106 IU/m5.0108 Iu/ml 范围 ，临界阳性质控品定量参考值在 2.0103 IU/ml5.0 105IU/ml 范围；阳性定量参考品：增长曲线呈 S 型曲线，ct 值27，且 0.97 r1；8 参考范围：1000IU/ml。9 操作性能：依据临床考

17、核，本试剂盒对处理后样品的灵敏度为 1.0103IUml ， 线性范围为 1.01031.0108IU/ml。10 临床意义：检测血清 HCV-RNA 已成为诊断 HCV 病毒血症的“金标准”。有利于病症的早期诊断、鉴别诊断，同时可为临床的用药剂量、时间等供给依据。11 方法局限性: 对于结果阳性的报告，只说明该样本中有病毒的遗传物质DNA 存在，并不说明有活病毒存在;虽然本试剂盒检测特异性、灵敏度均高，但检测结果为阴性的并不能排解样本含有病毒，只能说明样本中含有的病毒浓度低于本试剂盒的检测灵敏度。12 留意事项12.1 试验室治理应严格依据 PCR 基因扩增试验室的治理标准，试验人员必需进展专业培训，试验过程严格分区进展试剂预备区、标本预备区、扩增和产物分析区，所用消耗品应灭菌后一次性使用，试验操作的每个阶段使用特地的仪器和设备，各区各阶段用品不能穿插使用。12.2 试剂和标本预备阶段在生物安全柜内操作，试验过程中穿工作服，带一次性手套。12.3 对每次试验进展质量把握。12.4 试剂使用前要完全解冻，但应避开反复冻融。12.5 标本制备区所用过的吸头需打入盛有消毒容器，并与废弃物一起灭菌前方可丢弃。12.6 试验完毕用 75酒精或紫外线灯处理工作台和移液器。13 参考文献卫生部微生物生物医学试验室生物安全通用准则和医疗废物治理条例。