DB4107∕T 510-2023 鸡滑液囊支原体病净化防治技术规范(新乡市).pdf

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1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 4107 新乡市地方标准 DB4107/T 5102023 鸡滑液囊支原体病净化防治技术规范 2023-06-27 发布 2023-07-27 实施 新乡市市场监督管理局 发 布 DB4107/T 5102023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由新乡市农业农村局提出并归口。本文件起草单位：新乡市动物疫病预防控制中心，辉县市农业农村局，卫辉市农业农村局。本文件主要起草人：秦保亮、王磊、李春艳、王存炎、杜海燕、赵智灿、赵倩、梁自胜、徐凤忠。DB4107/T 51020

2、23 1 鸡滑液囊支原体病净化防治技术规范 1 范围 本文件规定了鸡滑液囊支原体病的术语和定义，规定了鸡滑液囊支原体病的诊断、监测、预防、治疗、净化与维持等防治技术规范。本文件适用于新乡市种鸡场、规模鸡场鸡滑液囊支原体病的净化防治。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 13078 饲料卫生标准 GB/T 36195 畜禽粪便无害化处理技术规范 NY/T 1167 畜禽场环境质量及卫生控制规范 NY/T 3075 畜禽养殖场消

3、毒技术 NY/T 4035 鸡滑液囊支原体感染诊断技术 NY 5027 无公害食品 畜禽饮用水水质 NY/T 5030 无公害农产品 兽药使用准则 中华人民共和国农业农村部第3号令.病死畜禽和病害畜禽产品无害化处理管理办法.2022年 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。鸡滑液囊支原体病 由鸡滑液囊支原体引起的关节渗出性滑膜炎、滑液囊和腱鞘发炎为主要特征的急性或慢性传染性疾病，也可引起气囊炎，甚至导致全身感染。净化 在种鸡场或规模养鸡场，通过持续不断的检测和监测鸡滑液囊支原体病，及时准确发现感染病例，淘汰患病鸡只，最终达到清除该病原的过程。4 诊断与监测 诊断 4.1.1 病原特性 D

4、B4107/T 5102023 2 鸡滑液囊支原体是一种介于病毒和细菌之间，没有细胞壁的原核生物，大小0.2m0.4m，革兰氏染色阴性，姬姆萨染色呈多形态的球形或球杆状。在pH6.9以下时不稳定，对39以上的温度敏感，-20可存活2年。在加入血清及辅酶的培养基中3 d7 d后形成隆起、圆形、略似花格状，直径1 mm3 mm的菌落。4.1.2 流行特点 病鸡、隐性带菌鸡、带菌种蛋是主要传染源。鸡滑液囊支原体主要感染412周龄的鸡，成年鸡和幼龄鸡也可发生。主要以直接接触经呼吸道水平传染和经种蛋垂直感染为主。本病潜伏期一般为8 d10 d。自然感染的潜伏期约20 d80 d，接触感染的潜伏期约为10

5、 d20 d，经蛋感染的雏鸡可见1周龄内发病。本病的急性感染期持续时间短，而慢性感染持续时间长，可终身带菌。初期为急性经过，急性期过后的慢性感染或隐形感染可持续数月至数年。生物安全体系不完善，饲养环境不良，如密度过大、空气不流通、潮湿、过冷，以及与其他致病因子混合感染，均可加重本病的感染程度。4.1.3 临床症状 感染病鸡精神不振，食欲下降，消瘦，冠苍白，严重时冠萎缩。由于所感染毒株的差异，部分病例表现为严重的关节病症，也有部分病例表现为严重的呼吸道症状，或二者兼有。关节病变型病例典型症状是跗关节和跖关节肿胀、跛行，甚至变形；慢性病例可见胸部龙骨出现硬结或囊肿；成年鸡只症状轻微，仅关节肿胀，体

6、重减轻。呼吸型病例表现为打喷嚏，咳嗽，鼻孔流出浆液性、黏液性直至脓性鼻液，严重者可出现眼睑肿胀，常在遭受应激后出现呼吸道症状。产蛋鸡产蛋量可下降20%30%，部分蛋壳尖端畸形异常。4.1.4 病理变化 关节病变型病例常出现腱鞘炎、滑膜炎和骨关节炎，病初水肿，有渗出物，呈黄色或灰色，清亮，有黏性，随病程发展，逐渐混浊，最终呈干酪状，特征性渗出物以跗关节和足垫较多。内脏器官一般不见特征性病变。呼吸型病例可见呼吸道黏膜水肿、充血、增厚，气管和喉头有粘液状物，严重感染可引起气囊浑浊、囊壁增厚、灰白色不透明，腔内含有大量干酪样渗出物。有时可见纤维素性或脓性心包炎、肝周炎和气囊炎，肝脏、脾脏、肾脏肿大，呈

7、斑驳状。实验室监测与判定 4.2.1 病原分离鉴定 参照NY/T 4035第5.2条款进行病原分离鉴定。4.2.2 血清学检测 血清学检测方面包括平板凝集试验（SPA)、血凝抑制试验（HI)、酶联免疫吸附试验（ELISA)等。具体操作方法见附录AC。在临床检测中，建议使用间接ELISA试剂盒进行批量检测。4.2.3 分子生物学检测 推进使用实时荧光定量PCR方法，操作步骤参照NY/T 4035进行分子生物学检测。4.2.4 结果判定 DB4107/T 5102023 3 符合4.1.2流行特点、4.1.3临床症状和4.1.4病理变化的，判为疑似感染。符合4.1.2流行特点、4.1.3临床症状和

8、4.1.4病理变化，且经4.2实验室检测，4.2.1病原的分离鉴定、4.2.3实时荧光定量PCR检测或4.2.2间接ELISA检测任何一项阳性者，可诊断为鸡滑液囊支原体感染。5 预防与治疗 预防 5.1.1 生物安全管理 5.1.1.1 引种与孵化管理 如从场外引种时，应按规定申报检疫，选择鸡滑液囊支原体阴性场进行引种。如本场自繁自养应在留种前进行血清学检测，选择阴性群留作种用。孵化时应将来自不同种鸡群的种蛋分开孵化，并实行小批量孵化，每批100200只。5.1.1.2 养殖环境管理 鸡场环境控制应参照标准NY/T 1167中的规定执行。实行全进全出制，每批鸡进舍前或出栏后应对鸡舍、笼具及用具

9、进行清洗、消毒，清理完毕后空舍至少2周。保证鸡舍的适宜温度，饲养密度要合理，舍内通风应良好，减少鸡群应激。及时清除潮湿的垫料和粪便，应按照GB/T 36195的规定处理。5.1.1.3 饲喂管理 饲料应符合GB 13078的要求。饲料存放防鼠防虫防鸟，饲喂器具要定时清洗、消毒，防止被粪便污染。采用自由饮水，水质应符合NY 5027的要求。5.1.2 免疫接种 弱毒疫苗主要用于祖代和父母代健康鸡。36周龄免疫，可与鸡毒支原体(MG)活疫苗联合使用，免疫前2周和免疫后4周不能使用支原体敏感药物。5.1.3 药物预防 药物使用应遵守NY/T 5030的规定执行，对种鸡在育雏期、青年期和产蛋期阶段使用

10、抗菌药物，能降低鸡滑液囊支原体在禽群中的感染。5.1.4 消毒 5.1.4.1 消毒制度 养殖场应建立消毒制度，包括对人员、车辆、用具，圈舍、道路、出入口，以及生产区、生活区等场内外的消毒严格管理，开展日常消毒、紧急消毒、空舍消毒和带鸡消毒。5.1.4.2 消毒方法 人员、车辆、用具、设备、道路、环境、空舍、带禽消毒以及发生疫病时的消毒按照NY/T 3075规定执行。治疗 5.2.1 药物使用 DB4107/T 5102023 4 药物使用应按照NY/T 5030的规定执行。采用轮换用药，以减少MS抗药性的产生。5.2.2 推荐药物和用法用量 泰妙菌素:有效物质含量按每100 g本品兑水500

11、 kg1000 kg或拌料500 kg，连用35 d。泰乐菌素:有效物质含量按混饮500 mg/L，连用5 d7 d；皮下或肌肉注射，按体重计，5 mg/kg13 mg/kg，每天2次，连用35 d。恩诺沙星:有效物质含量按皮下或肌肉注射，按体重计，2.5 mg/kg5 mg/kg，每天2次，连用2 d3 d；或按0.015%0.02%浓度拌料，连用3 d5 d。多西环素(强力霉素):有效物质含量按每100 g本品兑水500 kg1000 kg或拌料200 kg500 kg，连用3 d5 d。盐酸大观-林可霉素(比率为2:1)：有效物质含量按500 mg/L800 mg/L，混饮，连用5 d7

12、 d。6 净化与维持 祖代或父母代鸡场净化 祖代鸡场应从育雏阶段开展鸡滑液囊支原体净化。刚出壳雏鸡采集咽喉拭子进行PCR检测或病原分离鉴定；淘汰阳性鸡只，同时淘汰同群鸡只；检测阴性鸡只进行小群饲养。育成期全群采集血样进行SPA或ELISA检测，淘汰阳性鸡只，阴性鸡群进行小群饲养，作为后备育种鸡群。开产前按照育成期采血全群检测1次。商品代鸡场净化 净化开始阶段，全群进行血清学监测，每21 d检测一次，直至连续两次无阳性个体，建成阴性种鸡群，达到净化标准，净化进入维持阶段。净化维持阶段，对符合4.1.3的鸡立即采样检测，后备公鸡采精前、后备母鸡开产前全群采样、其它群每6月抽样检测一次。每群最少采样

13、数不少于30羽份。血清学检测出的阳性样品，或经4.2.1或4.2.3复核为阴性但随后血清学检测连续两次出现阳性的，则按净化开始阶段采样检测，直至连续两次无阳性个体，再次进入维持阶段。检测为阳性或疑似，立即淘汰。7 无害化处理 对病死鸡和废弃物的处理应符合病死畜禽和病害畜禽产品无害化处理管理办法规定；对粪便及其它可能被污染的物品按GB/T 36195中的规定进行无害化处理。对环境和设施进行消毒，参照NY/T 1167中的方法执行。8 档案管理 做好鸡滑液囊支原体病净化工作记录，并归档保存。记录内容包括：平板凝集检测抗原购进和检测记录、ELISA或PCR检测记录、各净化阶段种鸡的留种与淘汰记录等。

14、记录保存3年以上。DB4107/T 5102023 5 A A 附录A （规范性）鸡滑液囊支原体血清凝集试验(SPA)A.1 样品采集、保存与处理 从鸡群采集的血清样品，如不能立即进行试验，应4保存，保存期不超过72 h，不能冻结。血清在56水浴30 min后进行检测。A.2 试剂 试验用染色抗原、阳性及阴性对照血清。A.3 操作方法 室温中加一滴(20L)血清于白瓷板或玻板上，再加等量染色抗原，用加样枪头将其混合，轻轻摇动使之充分反应。室温条件下，鸡血清2 min内判定结果。试验设阳性血清及阴性血清对照。A.4 结果判定 按以下要求进行结果判断：规定时间内，发生完全凝集的，判为阳性。如仅在液

15、滴边缘部分出现凝集，或超过2 min在边缘出现凝集，判为可疑。超过规定时间无凝集者，判为阴性。DB4107/T 5102023 6 B B 附录B （规范性）鸡滑液囊支原体感染血凝抑制试验(HI)B.1 血凝试验(HA)测定 MS 抗原血凝价 试验在96孔“V”型微量反应板上进行。试验使用的MS标准抗原和标准阳性对照分装后于-20保存。试验使用的红细胞为新鲜的0.8%鸡红细胞悬液。常规倍比稀释法测定MS抗原的血凝价。以100%凝集(红细胞呈颗粒性伞状凝集于孔底)的MS抗原最大稀释孔为该MS抗原血凝价，即1个血凝单位。B.2 血凝抑制试验(HI)测定 MS 抗体血凝抑制价 试验在96孔“V”型微

16、量反应板上进行。试验使用的MS抗原分别含有4个血凝单位。试验使用的红细胞为新鲜的0.8%鸡红细胞悬液。去除待检血清中非特异性血凝因子：按照1 mL稀释待检血清(1:5)加68滴洗涤的鸡红细胞比例，37作用10 min后，除去红细胞，取上清液进行检测。B.3 试验程序 于第1孔中加入PBS 50L，再取4个血凝单位MS抗原依次加入38孔，每孔50L，第2孔加含有8个血凝单位的MS抗原50L；吸1:5稀释的待检血清50L于第1孔中，混匀后吸50L于第2孔中，依次倍比稀释至第8孔，最后弃去50L；置振荡器上振荡1 min；放室温下(1820)作用20 min；滴加50L 0.5%鸡红细胞悬液于各孔中

17、，振荡混合后，室温下静置3040 min，判定结果。B.4 结果判定 以100%抑制红细胞凝集的待检血清最大稀释度为该血清MS抗体血凝抑制价。血凝抑制价1:80以上判为MS抗体阳性，1:40血凝抑制价1:80时为结果可疑，21 d后再采血检测。DB4107/T 5102023 7 C C 附录C （规范性）鸡滑液囊支原体感染酶联免疫吸附试验(ELISA)C.1 材料和试剂 C.1.1 主要仪器 含490 nm波长酶标仪，37恒温设备，可调微量移液器。C.1.2 主要试剂 C.1.2.1 ELISA 抗原 支原体培养：鸡滑液囊支原体标准株接种支原体液体培养基，36摇动培养23天，已明显混浊的培养

18、液按8000 r/min离心20 min，沉淀用PBS在相同条件下洗3次。上述沉淀用PBS悬浮，超声波打碎后上清即为ELISA抗原。C.1.2.2 酶结合物 辣根过氧化物酶标记羊或兔抗鸡IgG抗体。C.1.2.3 阳性血清 MS抗原免疫SPF级鸡只3次获得的抗血清。C.1.2.4 阴性血清 无MS感染的SPF级鸡只血清。C.1.2.5 其他试剂 包被液(0.05 mol/L pH9.6)的配制：称取碳酸钠1.59 g和碳酸氢钠2.93 g溶于蒸馏水中并定容至1000 mL。洗涤液：取入Tween-20 0.5 mL加入到1000 mL PBS(0.01 mol/L pH7.4)中，充分混匀。稀

19、释液：含10%小牛血清的洗涤液。磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0)：称取柠檬酸3.26 g和磷酸氢二钠(Na2HPO4 12H2O)12.9 g溶于蒸馏水，并定容至700 mL。底物溶液：取邻苯二胺(OPD)4 mg和30%过氧化氢2L加入10 mL磷酸盐-柠檬酸缓冲液中溶解混匀。终止液(2 mol/L硫酸)：硫酸58 mL加入到442 mL蒸馏水中混匀。C.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)操作步骤 C.2.1 包被抗原 将最适工作浓度的抗原用包被液稀释。每孔100L，置371 h后，再4过夜。用洗涤液洗5次，每次3 min，拍干。C.2.2 加样 待检血清和阴性、阳性血清分别用稀释液做1:

20、40稀释，每孔加入100L，37孵育1 h，洗涤同上。C.2.3 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度，每孔加入100L，37孵育1 h，洗涤同上。DB4107/T 5102023 8 C.2.4 加底物溶液 每孔加入新配制的底物溶液100L，置37避光显色10 min15 min。C.2.5 终止反应 每孔加入终止液50L。C.2.6 测A值 在酶标仪上，于490 nm下测量和记录吸光值A(490)。C.3 结果判定 在阴性和阳性血清对照成立的条件下，进行结果判定。同时符合下列2个条件者，判为阳性；均不符合判为阴性；仅有1条符合者，判为可疑，需重试。a)待检血清的A值0.2；b)待检

21、血清的A值/阴性对照血清的A值2.10。DB4107/T 5102023 9 D D 附录D （资料性）鸡滑液囊支原体病净化评估标准 D.1 净化标准评估 同时满足以下要求，视为达到净化标准：种鸡群抽检，滑液囊支原体病原学检测均为阴性；连续两年以上无临床病例；种鸡群抽检，曾祖代、祖代鸡滑液囊支原体血清学抗体检测阳性率为0，父母代鸡滑液囊支原体血清学抗体检测阳性在1%以内；现场综合审查通过。D.2 抽检要求 D.2.1 血清学评估 种鸡群随机抽取150只血清，进行SPA血清学检测。曾祖代或祖代鸡群鸡滑液囊支原体抗体应全部为阴性，实验室检测通过；如抗体出现阳性，则实验室不通过。父母代鸡群鸡滑液囊支

22、原体抗体阳性率均应低于1%，实验室检测通过；如抗体阳性率高于1%，则实验室不通过。D.2.2 病原学评估 种鸡群(含所有群)随机按3%5%比例取棉拭子样品，进行PCR或病原学检测抽检，如果病原检测均为阴性，则判定种鸡达到鸡滑液囊支原体病净化状态，实验室检测通过；如果病原核酸检测阳性，则实验室不通过。DB4107/T 5102023 10 E E 附录E （资料性）鸡滑液囊支原体净化检测记录表 鸡滑液囊支原体检测记录表见表E.1。表E.1 鸡滑液囊支原体净化检测记录表 鸡场名称（栋舍）：检测日期：检测项目 鸡滑液囊支原体 抗原及标准血清批号 或试剂盒批号 血清平板检测阴性编号 血清平板检测阳性编

23、号 ELISA检测阴性编号 ELISA检测阳性编号 PCR检测阴性编号 PCR检测阳性编号 药物/疫苗使用情况 淘汰情况 DB4107/T 5102023 11 附录F （资料性）技术明白纸 F.1 病原 鸡滑液囊支原体是一种介于病毒和细菌之间，没有细胞壁的原核生物，大小0.2 m0.4 m，革兰氏染色阴性，姬姆萨染色呈多形态的球形或球杆状。在pH6.9以下时不稳定，对39以上的温度敏感，-20可存活2年。在加入血清及辅酶的培养基中3 d7 d后形成隆起、圆形、略似花格状，直径1 mm3 mm的菌落。F.2 流行特点 鸡滑液囊支原体主要感染412周龄的鸡。病鸡、隐性带菌鸡、带菌种蛋是主要传染源

24、。主要以直接接触经呼吸道水平传染和经种蛋垂直感染为主。潜伏期为8 d10 d。本病的急性感染期持续时间短，而慢性感染持续时间长，可终身带菌。初期为急性经过，急性期过后的慢性感染或隐形感染可持续数月至数年。生物安全体系不完善，饲养环境不良，如密度过大、空气不流通、潮湿、过冷，以及与其他致病因子混合感染，均可加重本病的感染程度。F.3 临床症状 感染病鸡精神不振，食欲下降，消瘦，冠苍白，严重时冠萎缩。关节病变型病例典型症状是跗关节和跖关节肿胀、跛行，甚至变形；慢性病例可见胸部龙骨出现硬结或囊肿；成年鸡症状轻微，仅关节肿胀，体重减轻。呼吸型病例表现为打喷嚏，咳嗽，鼻孔流出浆液性、黏液性直至脓性鼻液，

25、严重者可出现眼睑肿胀，出现呼吸道症状。产蛋鸡产蛋量可下降20%30%，部分蛋壳尖端畸形异常。F.4 病理变化 关节病变病例常出现腱鞘炎、滑膜炎和骨关节炎，病初水肿，有渗出物，呈黄色或灰色，清亮，有黏性，随病程发展，逐渐混浊，最终呈干酪状，特征性渗出物以跗关节和足垫较多。内脏器官一般不见特征性病变。呼吸型病例可见呼吸道黏膜水肿、充血、增厚，气管和喉头有粘液状物，严重感染可引起气囊浑浊、囊壁增厚、灰白色不透明，腔内含有大量干酪样渗出物。有时可见纤维素性或脓性心包炎、肝周炎和气囊炎，肝脏、脾脏、肾脏肿大，呈斑驳状。F.5 实验室监测 主要有病原分离鉴定、血清学检测和分子生物学检测。其中血清学检测方面

26、包括平板凝集试验（SPA)、血凝抑制试验（HI）、酶联免疫吸附试验（ELISA)等。F.6 预防与治疗 F.6.1 预防管理 从场外引种时，应按规定申报检疫，选择鸡滑液囊支原体阴性场进行引种。孵化时应将来自不同种鸡群的种蛋分开孵化，并实行小批量孵化，每批100200只。实行全进全出制，每批鸡进舍前或出栏后应对鸡舍、笼具及用具进行清洗、消毒，清理完毕后空舍至少2周。保证鸡舍的适宜温度，饲养密度要合理，舍内通风应良好，减少鸡群应激。及时清除潮湿的垫料和粪便。饲料存放应防鼠防虫防鸟，饲喂器具要定时清洗、消毒，防止被鸡粪污染。采用自由饮水。根据需要开展免疫接种和药物预防。DB4107/T 510202

27、3 12 F.6.2 消毒 养殖场应建立消毒制度，包括对人员、车辆、用具，圈舍、道路、出入口，以及生产区、生活区等场内外的消毒严格管理，开展日常消毒、紧急消毒，空舍消毒和带鸡消毒。F.6.3 治疗 药物使用应按照国家规定执行。采用轮换用药，以减少MS抗药性的产生。推荐药物和用法用量见下。泰妙菌素:有效物质含量按每100 g本品兑水500 kg1000 kg或拌料500 kg，连用3 d5 d。泰乐菌素:有效物质含量按混饮500 mg/L，连用5 d7 d；皮下或肌肉注射，按体重计，5 mg/kg13 mg/kg，每天2次，连用3 d5 d。恩诺沙星:有效物质含量按皮下或肌肉注射，按体重计，2.

28、5 mg/kg5 mg/kg，每天2次，连用2 d3 d；或按0.015%0.02%浓度拌料，连用3 d5 d。多西环素(强力霉素):有效物质含量按每100 g本品兑水500 kg1000 kg或拌料200 kg500 kg，连用3 d5 d。盐酸大观-林可霉素(比率为2:1)：有效物质含量按500 mg/L800 mg/L，混饮，连用5 d7 d。F.7 净化与维持 F.7.1 祖代或父母代鸡场净化 祖代禽场应从育雏阶段开展鸡滑液囊支原体净化。刚出壳雏鸡采集咽喉拭子进行PCR检测或病原分离鉴定；淘汰阳性鸡只，同时淘汰同舍鸡只；检测阴性鸡只进行小群饲养。育成期全群采集血样进行SPA或ELISA

29、检测，淘汰阳性鸡只，阴性鸡群进行小群饲养，作为后备育种鸡群。F.7.2 商品代鸡场净化 净化开始阶段，全群进行血清学监测，每21 d检测一次，直至连续两次无阳性个体，建成阴性种鸡群，达到净化标准，净化进入维持阶段。净化维持阶段，后备公鸡采精前、后备母鸡开产前全群采样、其它群每6月抽样检测一次。每群最少采样数不少于30羽份。血清学检测连续两次出现阳性的，则按净化开始阶段采样检测，直至连续两次无阳性个体，再次进入维持阶段。检测为阳性或疑似，立即淘汰。F.8 无害化处理 对病死鸡和废弃物的处理应符合有关规定；对粪便及其它可能被污染的物品按有关规定进行无害化处理。同时，应对环境和设施进行消毒。F.9 档案管理 做好鸡滑液囊支原体病净化工作记录，并归档保存。记录内容包括：平板凝集检测抗原购进和检测记录、ELISA或PCR检测记录、各净化阶段种鸡的留种与淘汰记录等。记录保存3年以上。