DB31∕T 955-2022 猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测方法(上海市).pdf

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1、ICS 11.220CCS B 41上海市地方标准DB31/T 9552022代替 DB31/T 9552015猪同环病毒3型实时荧光PCR检测方法Real-time PCR method for detection of porcine circovirus type 32022-11-09 发布2023-02-01 实施 发布 出版中国标准.上海市市场监督管理局DB31/T 9552022目 次前言.田1 范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理.15仪器设备.16耗材.27试剂.28样品采集与处理.29 DNA提取.310 实时荧光PCR检测.3附录A（规范性）溶液配制.5附录

2、B（规范性）引物和探针.6附录C（规范性）DNA提取方法.7附录D（规范性）荧光PCR反应体系.8DB31/T 9552022前 言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件代替DB31/T 9552015猪圆环病毒2a/2b亚型实时荧光PCR检测和分型方法，与 DB31/T 9552015相比，除编辑性改动外，主要技术变化如下：更改“缩略语”为“术语和定义”（见第3章,2015年版的第3章）；增加了耗材（见第6章）；更改了试剂（见第7章,2015年版的第6

3、章）；增加了粪便样品采集方法（见第8章）；删除了注意事项（见2015年版的第9章）；更改了附录A（见附录A.2O15年版的第6章）；增加了引物和探针（见附录B）；更改了 DNA提取方法（见附录C.2015年版的附录A）；增加了荧光PCR反应体系（见附录D）。本文件由上海市农业农村委员会提出并组织实施。本文件由上海市畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位:上海市动物疫病预防控制中心.本文件主要起草人:刘健、杨德全、葛菲菲、李鑫、白艺兰、沈海潇、赵洪进、王建、杨显超、周锦萍、鞠厚斌、李凯航、卢军、葛杰、桂亚萍。本文件所代替文件的历次版本发布情况为：-DB31/T 9552015 oinDB31

4、/T 9552022猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测方法1范围本文件规定了猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测方法的仪器设备、耗材、试剂、样品采集与处理、DNA提取和实时荧光PCR检测等技术要求。本文件适用于猪圆环病毒3型核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试睑方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1猪圆环病毒 3 型 porcine circovirus type 3；PC

5、V3属于圆环病毒科圆环病毒属新发猪病毒性传染病病原，表现为猪皮炎与肾病综合征的临床病症。3.2开放阅读框 open reading frame；ORF从起始密码子开始，是DNA序列中具有编码蛋白质潜能的序列，结束于终止密码子连续的碱基 序列。3.3循环数阈值 cycle threshold valueCt值每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理根据PCV3 ORF1序列，设计相应的引物和探针，建立实时荧光PCR检测方法。5仪器设备5.1 荧光PCR仪。5.2 研钵或组织研磨器。5.3 干热灭菌器。5.4 高速台式冷冻离心机：可控温至4，离心力可达12 000 r/min

6、以上。1DB31/T 95520225.5 水浴锅。5.6 普通冰箱：298匕。5.7 普通冰箱：一 181c以下。5.8 超低温冰箱：一70七以下。5.9 可调移液器：0.2 ML-2 mL05.10 可调移液器：0.5 PL1O mLo5.11 可调移液器：10 fL100 PLO5.12 可调移液器：20耳200山。5.13 可调移液器：100 rL1 0005.14 涡旋混匀器。5.15 高压灭菌锅。5.16 冰盒：一18 以下预冷。6耗材6.1 1.5 mL无菌离心管。6.2 0.2 mLPCR光学反应管。6.3 与可调移液器匹配的吸头。7成剂7.1 除特别说明以外，在检测中使用的试

7、剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682的要求。7.2 磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L PBS,pH 7.4),按附录A中A.1进行配制。7.3 DNAzol,商品化DNA抽提试剂，于2七8七保存。7.4 无水乙醇，一 18七以下预冷。7.5 75%乙醇，无水乙醇和灭菌去离子水配制，一18七以下预冷。7.6 2XPCR施预混液，按A.2配制，也可用等效的商品化预混液。7.7 引物和探针，其序列按照附录B合成。7.8 PCV3阳性对照和阴性对照：阳性对照使用组织培养灭活毒，一18七以下保存备用；阴性对照可采 用健康猪的组织材料。8样品采集与处理8.1 采样工具8.1.1 手术刀、剪子

8、、镒子，经160匕干热灭菌2 h。8.1.2 研钵或组织研磨器，经160七干热灭菌2 h。8.1.3 真空采血管。8.1.4 EDTA真空抗凝管。8.1.5 无菌棉拭广。8.1.6 5 mL无菌离心管。8.1.7 15 mL无菌离心管。2DB31/T 95520228.2 样用采集8.2.1 血清样品:用真空采血管采集受检猪静脉血2 mL,室温或者37 倾斜放置自然凝集20 min 30 min,2 000 r/min离心5 min,吸取不少于0.5 mL上清液至1.5 mL无菌离心管内备用。8.2.2 全血样品:用EDTA真空抗凝管采集受检猪静脉血2 mL,吸取1 mL全血置于1.5 mL无

9、菌离 心管内备用。8.2.3 拭子样品:用无菌棉拭子反复刮擦呼吸道黏膜5次10次,蘸取分泌物后将棉拭子放入5 mL 无菌离心管中，加入2 mLPBS,浸泡20 min30 min,振荡、挤干拭子，浸泡液采用4 000 r/min离心 1 min,吸取1 mL上清液至1.5 mL无菌离心管内备用。8.2.4 精液样品:取解冻或新鲜精液样品1 mL至1.5 mL无菌离心管中，振荡混匀，5 000 r/min离心 30 s,吸取不少于0.5 mL上清液至新的1.5 mL无菌离心管内备用。8.2.5 组织样品:无菌采集病死猪（包括流产胎儿）、扑杀猪，以及屠宰猪肺脏、淋巴结、脾脏、肾脏和扁 桃体，装入1

10、5 mL无菌离心管中，编号后送实验室。8.2.6 粪便样品:取猪新鲜粪便1 g,装入15 mL无菌离心管中，加入5 mL PBS,混匀。8.2.7 细胞培养物;细胞培养物反复冻融3次后，将细胞培养物置于1.5 mL无菌离心管中，编号备用。8.3 样品保存和运输依据8.1、8.2要求采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，在2 I8七下保存应不超 过24 h,-18七及以下可以稳定保存3个月，-70 C及以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行 运输,并在规定温度下的保存期内送达。8.4 样品处理8.4.1 血清、全血、拭子和精液样品无须进行前处理，直接用于核酸提取。8.4.2 组织样品；

11、取1 g组织样品，剪碎，加入2 mLpBS,制备组织匀浆，5 000 r/min离心10 min,吸取 不少于0.5 mL上清液至1.5 mL无菌离心管内备用。8.4.3 粪便样品：5 000 r/min离心10 min,吸取1 mL上清液至1.5 mL无曲离心管内备用。8.4.4 细胞培养物：4 000 r/min离心5 min,吸取1 mL上清液至1.5 mL无菌离心管内备用。9 DNA提取DNA提取方法按附录C执行。10实时荧光PCR检测10.1 反应体系的配制在试剂配制区内进行。设实时荧光PCR反应管数为明并宜按照+1个反应进行配制，按照附录 D配制每个反应的体系。配制反应液在冰盒中进

12、行。注：”为待检样品数+阳性管数+阴性管数。W.2反应液的分装将10.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀，按照每管20狂分装于0.2 mL PCR光学反应管中，做好标识转移至核酸提取区。3DB31/T 955202210.3 加样在核酸提取区进行。在每个反应管内加入待检样本的核酸5 mL,500 r/min-l 000 r/min离心30 s0 转移至检测区。10.4 上机检测10.4.1 荧光通道设置在检测区进行。将10.3离心后的PCR管放入荧光PCR检测仪中，设置报告荧光为HEX,采用其 他报告荧光时应按仪器说明设定对应通道，淬灭荧光设定为None,校准荧光设定为None,可根据不同 品

13、牌仪器说明等效设置参数。10.4.2 循环条件设置与检测检测分为三个阶段，a）第一阶段,95 C预变性3 min；b）第二阶段,95匕变性15 s,60 I退火、延伸、荧光采集40 s,40个循环；c）第三阶段,25匕冷却10 so检测结束后，保存结果，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。10.5 结果判定10.5.1 阑值设定阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚超过正常阴性样品扩增的最高点为准。10.5.2 质量控制阳性对照有典型S形扩增曲线，且Ct值430；阴性对照没有扩增曲线，且无Ct值或Ct值35；两 者均成立可判定试验成立,否则试验无效，需重新进行。10.5.3 结果判定

14、10.5.3.1 阳性判定:被检样品检测结果HEX通道Ct值030,且扩增曲线为典型的S形曲线，报告为 PCV3核酸阳性。10.5.3.2 阴性判定:被检样品检测结果HEX通道无C,值或Ct值35,且无典型的S形扩增曲线，报 告为PCV3核酸阴性。10.5.3.3 可疑判定:被检样品检测结果30VQ值435,且扩增曲线为典型的S形曲线，判定为可疑，可 疑样品重新检测,如重复检测结果仍然Ct值35，且扩增曲线为典型的S形曲线，报告为PCV3核酸阳 性，否则为阴性。4DB31/T 9552022附录A(规范性)溶液配制A.1 磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L PBS,pH 7.4)用 800 m

15、L 蒸储水溶解 8 g NaCU0.2 g KC1J.44 g Na2 HPO4 和 0.24 g KH2PO,。用 HC1 调节溶 液的pH值至7.4,加蒸储水至1 L.分装后经121t、20 min高压灭菌后备用。A.2 2XPCR酶预混液配制2XPCR酶预混液，使其热启动Tag酶终浓度为160 U/mL,Tris-HCl(pH8.4)终浓度为 40 mmol/L,KC1 终浓度为 100 mmol/L,MgCl2 终浓度为 6 mmol/L,dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 终 浓度均为400 jzmol/L。可采用商品化预混液。5DB31/T 9552022附最B（规范性）引

16、物和探针引物、探针的名称和序列见表B.l0表B.1引物、探针的名称和序列名称序列PCV3-F1（上游引物）5,-GGGAAAGCCCGAAACACA-3,PCV3-R1（下游引物）5JACTGCCTCCACACTCCACAAT-3PCV3-PM 探针）5-HEX-TACGATAAACAACTGGACCCCGACCGA-BHQl-3/注：引物和探针可由生物公司合成，用去离子水稀释至1。0“mol/L储存浓度，一20七以下保存备用,根据需要配 制成10 jxmol/L工作浓度，-20 t以下保存,供检测使用。6DB31/T 9552022附录C（规范性）DNA提取方法C.1在核酸提取区操作。DNA

17、抽提使用DNAzol试剂提取，也可以使用等效商品化试剂盒提取。C.2取”个1.5 mL灭菌离心管，其中n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行 标号。C.3每管先加入800 mL DNAzol,再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200 2L,颠倒10次混 匀,2 8 C 10 000 r/min 离心 10 min。C.4取900 KL上清液，置于新的1.5 tnL灭菌离心管中，加入500 jiL无水乙醇，混匀，室温放置3 min,2 8,C 10 000 r/min 离心 5 min。C.5穿上清液，沿管壁缓缓加入1 mL 75%乙醇，颠倒混匀3次6次，2七8 10 000 r/min离心 5 min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。C.6用50 KL去离子水溶解沉淀,直接用于检测，或置一70 C以下保存。7DB31/T 9552022附录D（规范性）荧光PCR反应体系荧光PCR反应体系见表D.1。表D.1荧光PCR反应体索组分1个检测反应的加入量2XPCR酶预混液12.5 ptLPCV3-FC10 jumol/L)0,5 fiLPCV3-RC10 pmol/L)0.5PCV3-PC10 Mmol/L)1 mL去离子水5.5/xL合计20 jitL8