DNA甲基化抑制物对雌激素受体β在乳腺癌细胞中表达的影响及意义.docx

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1、DNA甲基化抑制物对雌激素受体B在乳腺癌细胞中表达的影响及意义【摘要】目的：研究甲基化抑制物作用于乳腺癌细胞后对其ER -B表达的影响及意义。方法：抽取细胞总RNA,采用半定量逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测MCF-7与MDA-MB-231中ER- B 的表达状况。在两种细胞中按作用浓度加入甲基化抑制药物5-AZA -CdR,反应一定时间后用RT-PCR的方法测定药物处理后ER- 3的 表达情况，分析影响及意义。结果：MCF7的ERB平均表达水平 (0. 540. 44),药物处理后平均表达水平(0. 760. 53),较未经药 物处理的细胞明显升高(P【关键词】乳腺癌细胞；ERB；

2、DNA甲基化抑制剂文章编号:1009-5519 (2007) 17-2532-03中图分类号：R73文 献标识码：AEffect and significance of DNA methylation inhibitor on the expression of estrogen receptor- B in breast carcinoma cellsCHEN Du, QIAN Li-yuan, HUO Zhi-jun(Department of General Surgery II, Third Xiangya Hospital of Central South Univercity, C

3、hangsha 410013, China)Abstract Objective ： To investigate the expressionof ER6 in breast carcinoma cells before and after exposure to theDNAmethylationinhibitor. Methods： MDAMB 231 and MCF 7 cells were treated with 5-AZACdR. Total RNA was extracted from the treated and untreated cells and RT-PCR was

4、 used to determine the effect ofthe treatment on the expression of ER- 3 . Results： The expression of ER-3 in treated MCF7 cells was 0. 76 + 0. 63 and it was higher than the untreated MCF7 cells 0. 54 0. 44 (PKey words jBreastcarcinomacell； Estrogenreceptor- B (ER3 )； DNAmethylationinhibitor雌激素受体(ER

5、)是一类由配体激活的转录因子，是该受体的超 家族成员1。雌激素通过ER介导的信号传导在乳腺癌的发生发展 中起重要作用，雌激素的生理作用由雌激素受体a (ERa)和B(ERB)两种亚型介导，由两个独立的基因编码2。在正常的乳 腺组织中两种亚型均有表达，ER-3占优势，表达位点以乳腺导管 上皮细胞为主，在基质细胞也有表达。DNA甲基化是哺乳动物基因组的显著特征，正常DNA甲基化模式 如果被破坏就会导致细胞癌变，已发现多种肿瘤细胞中肿瘤抑制基因 的失活与该基因启动子区域CpG岛的过度甲基化有直接关系3。ER 的出现是对乳腺癌患者进行抗内分泌治疗的依据，大约2/3患者其乳 腺癌组织ER表达水平比正常人

6、高,这些肿瘤细胞一般分化较好,生长 转移缓慢,对抗内分泌治疗敏感,疾病缓解期长。但约1/4患者的乳腺 癌组织无ER表达,这些肿瘤常分化差,生长分数高，临床预后不良,对 抗内分泌治疗亦不敏感4。有研究表明ER基因甲基化与ER基因失 活有关，如果ER基因CpG岛甲基化是ER表达丢失的机制之一,那么 去甲基化必然引起ER基因再表达。本研究即针对甲基化抑制物 5-Aza-2-deoxycytidine(5AZA CdR)对乳腺癌细胞中 ERB 的 表达的影响，探讨去甲基化对乳腺癌治疗方面的意义。1资料和方法1. 1 一般资料：人类乳腺癌细胞株MDAMB 231和MCF7购 于湘雅细胞中心。DMEM和1

7、640细胞培养液购自美国Hyclone公司， 新生牛血清购自杭州四季青生物公司。5AZACdR购于德国Merck 公司oTrizol购于Invitrogen公司，逆转录试剂盒为Fermentas(EU) 产品。MDAMB 231是ER (-)的高侵袭性人乳腺癌细胞株，用含 15%新生牛血清的RPMI 1640培养基培养；MCF7是ER ( + )的低 侵袭性人乳腺癌细胞株，用含15%新生牛血清的高糖DMEM培养基培 养，置于37 二氧化碳恒温水浴箱中培养。5-AZA-CdR粉剂5mg 用DMS0溶解制成浓度为5 Mm的原液，置于一80冰箱中储藏。1. 2检测方法：细胞用100ml玻璃培养瓶培养

8、，每瓶加入相应培 基810 ml,在电镜下观察，待细胞贴壁生长面积大于瓶壁面积的80% 时，用0. 25%胰酶消化后转移至无菌离心管中1 000转离心5分钟， 弃去上清液，用D hanks液冲洗23遍，加入D hanks液5 ml吹 打混匀，再次1 000转离心5分钟，弃上清，加入预冷Trizol约1ml 移入1.5 ml EP管内，加入0.2 nil氯仿，剧烈振荡15秒，按照Trizol 操作说明书步骤提取细胞总RNA后，再在Gene Amp 2 400P扩增仪上进行RTPCR,根据紫外可见分光光度计测的各管总RNA浓度，0D 值1.8者为理想，各取2 ulmRNA做逆转录成cDNA。逆转录

9、条件：5X 逆转录反应缓冲液 4 y 1, 10 mmol/ L dNTP 2 n 1, Olig(DT) 18primer 1 U 1, RNA 酶抑制齐！J (Ribolock Ribonnclease inhibitor) 1 u 1, Aid 逆转录酶1 ul,加无核酸酶水至终反应体系20 ul, 70 变性5 分钟，37 孵育5分钟,42 60分钟，70 10分钟。反应完毕 后取出，冰上放置5分钟，将生成的cDNA置于- 20 保存。Primer-5 设计引物参照文献设计合成，ER-3 上游引物序列 5-TGCTCCTGGCAACTACTTCA-3,下 游 引 物 序 列5 -GAC

10、AGGAGCATCAGGAGGTT-3,0内参照 B actin 上游引物： 5,GGACCTGACTGACTACCTA 3,下游引物：5?TCATACTCCTGCTTGCTG 3。 在MDA-MB-231和MCF-7的培养瓶中按10ml培基各加入终浓度为 5 Mm的5-AZA-CdR原液5口1使得培养瓶内的药物浓度为2.5 nmol/L, 48小时后抽取药物干预后的细胞总RNA并将其逆转录成 cDNA 20保存，方法同前。1.3 ERB的PCR反应条件：95 预变性5分钟，95 变性1分钟，57 退火1分钟，72 延伸1分 钟，共35循环，72 延伸10分钟。取目的基因和内参基因的PCR 产

11、物各4 U1与载样液混和后(按4 ： 1),分别加入2%琼脂糖凝胶电 泳检测并照相保存,各目的基因扩增重复35次，取均值。在图像分 析系统上观察分析，用平均吸光度乘以条带面积的值表示总的吸光度 值，代表各基因的mRNA量。以目的基因与内参基因的A值的比值表 示ER- B mRNA的相对表达水平。1.4统计学方法：采用SPSS12.0. 1软件进行统计学分析。ER- B mRNA表达水平采用独立样本t检验，以P2结果2. 1 MCF-7的ERB平均表达水平(0. 540. 44),药物处理 后平均表达水平(0. 760. 53),较未经药物处理的细胞明显升高(P2. 2非雌激素受体依赖的MDAM

12、B 231,未用药物干预之前不 表达ERB,药物处理后ER-3出现表达，其表达的平均水平为(0. 320. 11), P2.3经5-AZA-CdR作为甲基化抑制剂对于乳腺癌细胞具有一 定的抑制生长和杀伤作用。见图3。2. 4 在经 5AZACdR 干预 48 小时后 MCF7 和 MDAMB 231 细胞均有部分形态改变或死亡。见图4。2. 5乳腺癌细胞中用药物干预后ER- 3 mRNA的表达：见表1。 用PCR电泳法显示的内参基因及目标基因：见图5。3讨论既然某些特定生长相关基因的点突变和基因表达缺失与DNA甲 基化机制有关，那么修正基因的甲基化状态就有可能成为一新的肿瘤 治疗途径5。乳腺癌

13、作为女性最常见的恶性肿瘤，早发现、早诊断具 有重要意义。肿瘤相关基因启动子的高甲基化是恶性细胞的普遍现象, 且常发生在肿瘤进程早期。目前这种现象已在许多类型恶性肿瘤中得 到验证，有可能成为评估肿瘤风险、制定预防策略、获得早期诊断、 跟踪肿瘤预后的指标及作为肿瘤化疗、抗内分泌治疗的生物学标志6o ER能作为依赖雌激素的生长因子，如它能在ER阴性细胞中恢 复表达,就能通过其他抑制因子基因再表达从而达到抑制肿瘤细胞生 长。因此，DNA甲基化抑制物出现是乳腺癌治疗的又一前景4。DNA 去甲基化可以诱导乳腺癌ER-8表达增强或再表达，对于提高乳腺癌 的内分泌治疗疗效和指导新辅助化学治疗有重大意义。但DN

14、A去甲基 化恢复ER再表达的机制尚待进一步探讨。参考文献：.1 Bord S, Hornor A, Beavan S, et al. Estrogenreceptorsalpha and beta are differentially expressed in developing human boneJ. J Clin En-docrinol Metab, 2001, 86(5):2309.2张桂香，赵学东.雌激素受体亚型的研究现状J,国外医学 妇产科学分册，2002, 29 (6)： 352.3 Baylin SB , Herman JG. DNA hypermethylation in

15、tumorigenesis:epi-genetics joins geneticsJ. Trends Genet, 2000, 16(4)： 168.4周林艳，张徽.DNA甲基化对乳腺癌雌激素受体的调控J. 国外医学肿瘤学分册，2004, 31 (4)： 270.5刘永忠，冒国光.DNA甲基化与肿瘤发生、治疗的研究进展 J.中国癌症杂志,1999, 9 (3)： 258.6 Palmisano WA , Divine KK , Saccomanno G, et al. Predictinglung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputumJ. Can-cer Res, 2000, 60(21):5954.收稿日期:2007-04-20