DB42_T 1864.2-2022 家禽疫病诊断技术规程 第2部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测.docx

《DB42_T 1864.2-2022 家禽疫病诊断技术规程 第2部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DB42_T 1864.2-2022 家禽疫病诊断技术规程 第2部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测.docx（10页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、ICS11.220CCSB41DB42湖北省地方标准DB42/T1864.22022家禽疫病诊断技术规程第2部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测CodeforpracticediagnostictechniquesofpoultrydiseasesseriesPart2:TestmethodofdualprobePCRfordetectingpathogenicEscherichiacoli2022-05-26发布2022-07-26实施湖北省市场监督管理局发布DB42/T1864.22022目次前言.II引言.IV1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.15原理.16试验条件

2、.27仪器设备.28试剂或材料.29试验步骤.310结果判定.411生物安全措施.4IDB42/T1864.22022前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件DB42/T1864家禽疫病诊断技术规程为系列标准。本部分为DB42/T1864的第2部分。DB42/T1864发布了以下部分：第1部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。第2部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测第3部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜酸菌和空肠弯曲菌三重荧光PCR检测方法。第4部分：禽白血病抗原ELISA检测方法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专

3、利的责任。本文件由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本文件由湖北省农业农村厅归口管理。本文件起草单位：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：张文婷、罗青平、邵华斌、周艳君、金鑫、张腾飞、温国元、王红琳、商雨、汪宏才、张蓉蓉、卢琴、罗玲。本文件实施应用的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：hbsnab；在执行过程中有意见和建议请反馈至湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，联系电话：027-87284950，邮箱：wentingzhang87IIDB42/T1864.22022引言近年来，我国高度重视动物传染病的预防和控制工作

4、，在国务院颁布的国家中长期动物疫病防治规划（20122020年）中明确要求进一步做好种禽场疫病净化、加强疫病检测诊断能力建设。家禽及蛋制品产业链是湖北省的十大重点产业链之一，为了加快湖北省重点农业产业链建设，保证家禽养殖健康与食品安全，依据湖北省重点农业产业链实施方案，对影响家禽及蛋制品产业链的禽白血病、禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌等家禽重要疫病开展快速检测方法研究。为加快我省家禽疫病净化进程，提升疫病的监测、检测效率，促进我省家禽业持续健康发展，起草组围绕家禽疫病防控的需要，研制了家禽疫病诊断技术规程系列标准，拟由4个部分构成。第一部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。目的在于开展家禽J亚群白血病病毒

5、、马立克氏病病毒、网状内皮组织增生症病毒的快速检测，指导家禽肿瘤病的快速鉴别诊断。第二部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测。目的在于检测家禽泄殖腔拭子和粪便中的致病群大肠杆菌，指导家禽致病群大肠杆菌的快速检测。第三部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光PCR检测方法。目的在于检测鸡肉及相关产品、鸡泄殖腔拭子和粪便中的沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌，指导鸡肉及相关产品细菌性疾病的快速检测。第四部分：禽白血病抗原ELISA检测方法。目的在于检测种鸡群蛋清、血浆、精液、胎粪、肛拭子中禽白血病抗原ELISA检测，指导种鸡场禽白血病的净化检测。IVDB42/T1864.22022家禽疫病

6、诊断技术规程第2部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测1范围本文件规定了禽致病群大肠杆菌双重探针检测方法所需检测仪器、试剂、样品、检测步骤及结果判定。本文件适用于检测家禽泄殖腔拭子和粪便中的致病群大肠杆菌。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测NY/T555动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方

7、法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1大肠杆菌致病群escherichiacoliphylogeneticgroup根据系统进化分类，将大肠杆菌分为B2、D、B1和A群，其中B2群和D群大肠杆菌称为致病群大肠杆菌。3.2荧光PCRrealtimePCR一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BHQ1：黑洞淬灭剂-l（BlackHoleQuencher-1）Ct值：循环阈值（Cyclethreshold）FAM：荧光素酰胺（FluoresceinAmidite）HEX：六氯荧光素（Hexachloro-F

8、luorescein）5原理1种群chuAyiaATspE4.C2B2/D/B1/A/注：“”表示该基因检测为阳性，“”表示该基因检测为阳性，“/”表示不检测该基因。DB42/T1864.22022本文件采用Taqman双重探针法对家禽大肠杆菌中的致病群进行筛选。该方法的原理是：种系发生分群是大肠杆菌分子流行病学的重要特征，依据chuA基因、yiaA基因和DNA片段TspE4.C2的有无，大肠杆菌可被分为B2、D、B1和A四个种群（表1）。流行病学资料显示，B2群和D群为主要的致病群。针对禽源大肠杆菌毒力岛基因chuA和yiaA，设计特异的引物和荧光探针，建立了一种禽大肠杆菌致病群筛选的Taq

9、man双重探针检测方法，根据对应的荧光曲线反应和Ct值来判断禽大肠杆菌的致病群。表1大肠杆菌种群的判定6试验条件实验操作应在室温（1825）下进行。样品前处理及菌株分离鉴定应在二级生物安全柜中进行。7仪器设备7.1荧光定量PCR仪。7.2二级生物安全柜。7.3涡旋震荡器。7.4微量移液器（规格为1mL、100L、50L和2.5L）。7.5恒温培养箱：361。7.6台式冷冻小型离心机（转速12000r/min）。8试剂或材料8.1试剂配制本方法试验用水应按照GB/T6682中规定的二级水，所有实验用试剂均为分析纯。试剂配制按照GB/T27403规定实施。8.2试剂或材料8.2.1Cary-Bla

10、ir运送培养基。8.2.2荧光定量PCR探针预混物。8.2.3商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒。8.2.4chuA基因引物与探针：上游引物5-CTGGGTGGAGTGATCTCCTA-3，下游引物：5-TGCCGCCAGTACCAAAG-3，探针：5-FAM-TTGCAGGAAGGACAAAGCAGTGGT-BHQ1-3。8.2.5yjaA基因引物与探针：上游引物5-GAAAGCAAACGTGAAGTGTCAG-3，下游引物：2DB42/T1864.220225-GGTGGAGTTGCAGAACAAGA-3，探针：5-HEX-CCAGCGCCTGTTAATCGCCAATTT-BHQ1-3。8

11、.2.6阳性对照1：chuA基因的阳性克隆分子DNA或阳性标准菌株DNA。8.2.7阳性对照2：yjaA基因的阳性克隆分子DNA或阳性标准菌株DNA。8.2.8阴性对照：无菌蒸馏水或去离子水。8.2.9无DNase/RNase的qPCR管、EP管（1.5mL）、微量移液器对应的枪头。9试验步骤9.1样品的采集与前处理9.1.1泄殖腔拭子样品用无菌的棉拭子插入鸡泄殖腔内2cm至3cm处并轻轻旋转，将有可见粪便的棉拭子放入含有1mL2mL运送培养基中，冷藏箱保存，样品保存时间不超过24h。9.1.2粪便样品先采集鸡新鲜粪便1g2g于一次性无菌采便管内，然后转移至含有1mL2mL运送培养基中，冷藏箱

12、保存，样品保存时间不超过24h。9.2大肠杆菌的分离鉴定大肠杆菌的分离鉴定按照NY/T555的规定执行。9.3样品DNA的制备9.3.1对于鉴定后的菌株，接种于营养肉汤中，361培养18h24h。12000r/min离心2min，去尽上清，沉淀用于核酸提取。9.3.2在沉淀中，加入100LDNA提取液充分混匀，沸水浴10min，在4下12000g离心5min，上清可直接用于荧光PCR反应。9.3.3也可以使用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA模板，具体步骤参照说明书。9.4荧光PCR检测9.4.1反应体系以制备的DNA为模板进行双重荧光定量PCR反应。反应体系体积为25L，上、下游引物（10m

13、mol/L）各0.6L，探针（10mmol/L）各0.8L，荧光定量PCR探针预混物12.5L，模板DNA1L。用灭菌的去离子水补足体积至25L。9.4.2反应条件荧光PCR反应在多通道荧光定量PCR仪上进行，选择荧光信号FAM和HEX（分别检测chuA-FAM，yjaA-HEX）。反应参数：95预变性5min；然后95变性10sec，58.1退火并延伸30sec，扩增40个循环；延伸结束时开始进行双重荧光信号检测。阈值设置为阈值线超过正常阴性样品扩增曲线的最高点。9.4.3对照3通道Ct值结果分析FAM35报告为chuA基因荧光PCR检测阳性无Ct值或40检测样品低于检测限或没有，报告为ch

14、uA基因荧光PCR检测阴性3540Ct值在3540之间为灰值区域，对样品重新提取基因组，再检测一次，重做后Ct值37且有扩增曲线的报告为chuA基因荧光PCR检测阳性，其余则报告为chuA基因荧光PCR检测阴性HEX35报告为yjaA基因荧光PCR检测阳性无Ct值或40检测样品低于检测限或没有，报告为yjaA基因荧光PCR检测阴性3540Ct值在3540之间为灰值区域，对样品重新提取基因组，再检测一次，重做后Ct值37且有扩增曲线的报告为yjaA基因荧光PCR检测阳性，其余则报告为yjaA基因荧光PCR检测阴性结果报告判定标准B2群禽大肠杆菌检测阳性chuA基因荧光PCR检测阳性、yjaA基因

15、荧光PCR检测阳性D群禽大肠杆菌检测阳性chuA基因荧光PCR检测阳性、yjaA基因荧光PCR检测阴性禽大肠杆菌致病群检测阴性chuA基因荧光PCR检测阴性、yjaA基因荧光PCR检测阴性DB42/T1864.22022检测过程中分别设阳性对照1、阳性对照2与阴性对照。10结果判定10.1质控标准阴性对照（无菌水）无Ct值或Ct值35，无扩增曲线；阳性对照品FAM和HEX通道检测结果的Ct值均30，扩增曲线明显呈对数增长；如果阴性对照或者阳性对照有一项不符合标准则本次检测无效。10.2结果分析检测结果的判定应按照表2、表3规定。表2chuA、yjaA基因检测结果的分析表3大肠杆菌致病群的判定10.3检测注意事项本方法是基于DNA的检测，检测结果阳性表示核酸阳性。实验过程应避免环境污染，试剂污染，样品交叉污染。11生物安全措施生物安全措施按照GB19489实验室生物安全通用要求。4