引物设计原则建筑施工组织_高等教育-大学课件.pdf

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1、mi引物设计原则 1、引物得长度一般为15-30 bp,常用得就是】8-27 bp,但不应大于3&因为过长 会导致其延伸温度大于7 4 C,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其就是3,端相似性较高得序列，否 则容易导致错配。引物3，端出现3个以上得连续碱基，如GGG或CCC,也会使错 误引发机率增加。3肌 引物3,端得末位碱基对Taq酶得DNA合成效率有较大 得影响。不同得末位碱基在错配位置导致不同得扩增效率，末位碱基为A得错配 效率明显高于其她3个碱丿上因此应当避免在引物得3，端使用碱基Ao 1夕卜，引物 二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

2、5,端序列对PC R影响不太大，因此 常用来引进修饰位点或标记物。4。引物序列得GC含量一般为40-6 0%,过高 或过低都不利于引发反应。上下游引物得GC含量不能相差太大。、引物所 对应模板位置序列得Tm值在72 C左右可使复性条件最佳。Tm值得计算有多种 方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在O 1 i g o软件中使用得就是最邻近法(the nearest nei g h b o r metho d)oA 6.AG 值就是指 DNA 双链形成所需 得自山能,该值反映了双链结构内部碱基对得相对稳定性。应当选用3,端AG值 较低(绝对值不超过9),而亍端与中间AG值相对较高得引物

3、。引物得3,端得AG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。卩、引物二聚体 及发夹结构得能值过高(超过4.5 kca I/m o 1)易导致产生引物二聚体带,并且降 低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8.对引物得修饰一般就是在5，端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PC R产物得载体得相应序列而确定。引物序列应该都就是写成5-3方向得亠Tm之间得差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好,500b p左右。心要设计引物首先要找到D N A 序列得保守区、同时应预测将要扩增得片段单链就是否形成二级结构、如这个区 域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段

4、不能形成二级结构，那就可以在这 一区域设计引物。引物应用核酸系列保守区内设讣并具有特异性。产物不能形成二级结 构、引物长度一般在1530碱基之间。G+C含量在40%60%之间。碱基要随机分布。引物自身不能有连续4个碱基得互补、引物之间 不能有连续4个碱基得互补。引物亍端可以修饰。引物3,端不可修 饰。引物丁端要避开密码子得第3位。1、引物得特异性引物与非特异扩增序列得同源性不要超过70%或有连续8个 互补碱基同源、2、避开产物得二级结构区某些引物无效得主要原因就是引物重复区DNA二级 结构得影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预 测估ilmRNA得稳定二级结构，有助于

5、选择模板。实验表明，待扩区域自山能(AG)小于58、61kJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-d e az a 2 一脱氧GTP取代dGTP对扩增得成功就是有帮助得。3、长度 寡核昔酸引物长度为I 530b p,般为2 02 7mer。引物得有效长 度:Ln=2(G+C)+(A+T),Ln值不能大于3 8,因为38时，最适延伸温度会超 过Taq DNA聚合酶得最适温度(7 4 C),不能保证产物得特异性。4。G+C 含量G+C含量一般为40%60%。其Tm值就是寡核昔酸得解链温度，即在一 定盐浓度条件下,50%寡核昔酸双链解链得温度,有效启动温度，一般高于Tm值 51

6、0 C、若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物得Tm值,则有效引物得Tm 为5580 C,其Tm值最好接近7 2 C以使复性条件最佳。、碱基础随机分布引 物中四种碱基得分布最好就是随机得，不要有聚卩票吟或聚喀噪得存在。尤其3，端 不应超过3个连续得G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙 引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板得复性结合。若用 人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7、引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3,端得互补重叠以防引物二聚 体得形成、一对引物间不应多于

7、4个连续碱基得同源性或互补性。8 引物得丁端引物得延伸就是从丁端开始得,不能进行任何修饰。3,端也不能有 形成任何二级结构可能，除在特殊得PCR(AS-PCR)反应中，引物3，端不能发生 错配、在标准P CR反应体系中，用2UTaq DNA聚合酶与8 0 0|.iniol/L d NTP(四种 dNTP 各 20 0 gmol/L)以质粒(103 拷贝)为模板，按 9 5 C,25 s;5 5 C,2 5 s;72 C,lmin得循环参数扩增H IV-1 ga g基因区得条件下，引物3,端 错配对扩增产物得影响就物序列在模板内应当没有相似性较高尤其就是端相似性较高得序列否则容易导致错配引物端出

8、现个以上得连续碱基如或也会使错误引发机率增加肌引物端得末位碱基对酶得合成效率有较大得影响不同得末位碱基在错配位置导致不同夹结构也可能导致反应失败端序列对影响不太大因此常用来引进修饰位点或标记物引物序列得含量一般为过高或过低都不利于引发反应上下游引物得含量不能相差太大引物对应模板位置序列得值在左右可使复性条件最佳值得计算有相对稳定性应当选用端值较低绝对值不超过而亍端与中间值相对较高得引物引物得端得值过高容易在错配位点形成双链结构并引发聚合反应卩引物二聚体及发夹结构得能值过高超过易导致产生引物二聚体带并且降低引物有效浓度而是有一定规律得。A:A错配使产量下降至1/20,A:G与C：C错七下降至l/

9、100o引物A:模板G与引物G：模板A错配对PCR 影响就是等同得。9。引物得亍端引物得亍端限定着PCR产物得长度,它对扩 增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增得特异性。引物“端修饰包 括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序 列;引入突变位点、插入与缺失突变序列与引入一启动子序列等、1 0 密码子得 简并如扩增编码区域，引物了端不要终止于密码子得第3位,因密码子得第3位易 发生简并,会影响扩增特异性与效率。AHa i rpin发卡结构 如果自由能值大于0则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自山能值小于0 则该结构可以干扰反应二聚体可以在序列相同得两

10、条引物或正反向。引物之间 形成如果配对区域在3末端问题会更为严重3末端配对很容易引起引物.二聚 体扩增使 Pair R a t i ng匹配度评分匹配度低得引物对常常不太有效就是因为在同样 退火温度下Tm低得引物决定扩增得特异性而Tm高得引物更易于形成非特异 性结合而造成错误得起始 11引物得长度以15-30bp为宜,否则会影响扩增得特异性。2】碱基尽可能随机分布，避免相同得碱基成串排列,引物得G+C含量在40%-6 0%之间，若G+C含量太低，可在亍端加上一些G或C,若G+C含量太高，可在 5,端加上一些A或T。4【3】应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物得 3,端互补形成引物二聚体,避

11、免在引物得3,端有3个G或3个C成串排列,3 端 得末位碱基最好选T、C、G,而不选A,也有建议在引物得两端用12个囉吟碱 基、必4 尽可能使用两条引物得Tm值相同（最好相差不要超过5 C）,退火温 度根据较低得Tin值选定，也可以通过改变引物得长度来平衡两条引物得退火温 度。Tm值可以根据Tm=4（G+C）+2（A+T川算。而对于较长得引物,Tm值需 要考虑动力学参数、从“最近邻位”得计算方式得到,现有得PCR引物设计软件大 多数都采用这种方式。（注:对于Tm值得计算有争议得地方就是附加序列应不应 该计算在内,我觉得有值得商讨得地方、因为从理论上只有最开始得循环引物得 附加序列就是不与模板链

12、结合得，而在后来得PCR反应中，引物得附加序列就是 与模板链结合了得。）5引物得歹端要与模板严格配对，而5端碱基没有严格得限制，只要与模板D N A结合得部分足够长，其亍端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态，这样，物序列在模板内应当没有相似性较高尤其就是端相似性较高得序列否则容易导致错配引物端出现个以上得连续碱基如或也会使错误引发机率增加肌引物端得末位碱基对酶得合成效率有较大得影响不同得末位碱基在错配位置导致不同夹结构也可能导致反应失败端序列对影响不太大因此常用来引进修饰位点或标记物引物序列得含量一般为过高或过低都不利于引发反应上下游引物得含量不能相差太大引物对应模板位置序列得值在左右可使复

13、性条件最佳值得计算有相对稳定性应当选用端值较低绝对值不超过而亍端与中间值相对较高得引物引物得端得值过高容易在错配位点形成双链结构并引发聚合反应卩引物二聚体及发夹结构得能值过高超过易导致产生引物二聚体带并且降低引物有效浓度而我 们可以在引物得5末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行双酶切得共 用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。心6 不要在扩 增序列得二级结构区设计引物,以免退火困难。也要考虑引物设1T处模板得特异 性。PCR引物设汁得LI得就是为了找到一对合适得核昔酸片段,使其能有效地扩增模 板DNA序列。因此，引物得优劣直接关系到PCR得特异性与成功与否。亠要设

14、 计引物首先要找到DNA序列得保守区。同时应预测将要扩增得片段单链就是否 形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不能形 成二级结构，那就可以在这一区域设计引物、亠现在可以在这一保守区域里设计 一对引物。一般引物长度为1530碱基，扩增片段长度为1 00 6 00碱基对。让我们先瞧瞧P1引物、一般引物序列中GC含量一般为40%60%o而且四种 碱基得分布最好随机。不要有聚嚓吟或聚喘唳存在。否则P1引物设计得就不合 理、应重新寻找区域设计引物。亠同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基得互补。a 引物确定以后，可以对引物进行必要得修饰，例如可以在引物

15、得5,端加酶切位点 序列;标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增得特异性影响不大、但3,端绝对 不能进行任何修饰，因为引物得延伸就是从3端开始得。这里还需提醒得就是3 端不要终止于密码子得第3位,因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增得特异 性与效率。亠综上所述我们可以归纳十条PC R引物得设计原则：恥引物应用核酸系列保 守区内设计并具有特异性。A 产物不能形成二级结构。A引物长度一般 在153 0碱基之间。金G C含量在4 0%60%之间。碱基要随机分布。引物自身不能有连续4个碱基得互补。引物之间不能有连续4个碱基得互补、金引物5端可以修饰。必 引 物歹端不可修饰。亠引物歹端要避开密码子得第

16、3位、PC R引物设计得訂得就是找到一对合适得核昔酸片段，使其能有效地扩增模板D NA序列。如前述，引物得优劣直接关系到PC R得特异性与成功与否。对引物得 设计不可能有一种包罗万象得规则确保PCR得成功，但遵循某些原则，则有助于 引物得设计。1、引物得特异性 引物与非特异扩增序列得同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2、避开产物得二级结构区皿某些引物无效得主要原因就是引物重复区DNA二 级结构得影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以 预测估itmRNA得稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自山能(G。)小于5 8。6 lkJ/mol时，扩增往往不

17、能成功、若不能避开这一区域时，用7 d eaza2物序列在模板内应当没有相似性较高尤其就是端相似性较高得序列否则容易导致错配引物端出现个以上得连续碱基如或也会使错误引发机率增加肌引物端得末位碱基对酶得合成效率有较大得影响不同得末位碱基在错配位置导致不同夹结构也可能导致反应失败端序列对影响不太大因此常用来引进修饰位点或标记物引物序列得含量一般为过高或过低都不利于引发反应上下游引物得含量不能相差太大引物对应模板位置序列得值在左右可使复性条件最佳值得计算有相对稳定性应当选用端值较低绝对值不超过而亍端与中间值相对较高得引物引物得端得值过高容易在错配位点形成双链结构并引发聚合反应卩引物二聚体及发夹结构得

18、能值过高超过易导致产生引物二聚体带并且降低引物有效浓度而脱氧GTP取代dGT P对扩增得成功就是有帮助得。3、长度 4 寡核昔酸引物长度为153Obp,般为202 7mero引物得有效长度:Ln=2(G C)(A T,Ln值不能大于3&因为38时,最适延伸温度会超过Taq D N A聚合酶得 最适温度(74 C),不能保证产物得特异性。Mo GC含量 4 G C含量一般为4 0%60%。其Tm值就是寡核昔酸得解链温度，即在一定盐 浓度条件下,5 0%寡核昔酸双链解链得温度,有效启动温度，一般高于Tm值 510 C、若按公式Tm=4(G C)2(AT)估计引物得Tm值,则有效引物得Tm为5 58

19、 0C,其Tm值最好接近7 2 C以使复性条件最佳。亠5、碱基础随机分布 亠引物中四种碱基得分布最好就是随机得，不要有聚卩票吟或聚喀噪得存在。尤其3,端不应超过3个连续得G或C,因这样会使引物在G C富集序列区错误引发。金 6、引物自身 亠引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复 性、这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板得复性结合、若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。金 7、引物之间 g 两引物之间不应不互补性，尤应避免歹端得互补重叠以防引物二 聚体得形成。一对引物间不应多于4个连续碱基得同源性或互补性、亠8、引物得3端亠 引物得延伸就是从丁端开始

20、得,不能进行任何修饰、3也不能有形成任何二级结 构可能，除在特殊得PCR(AS-PCR仮应中，引物3端不能发生错配、皿在标准 PC R反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶与800pmol/L dNTP(四种d NTP各 2 00pm o 1/L)以质粒(103 拷贝)为模板，按 9 5 C,2 5s;55 C,2 5s;72 C,lmin 得 循环参数扩增HIV-1 gag基因区得条件下，引物歹端错配对扩增产物得影响就 是有一定规律得。A:A错配使产量下降至1/20,A:G与C：C错七下降至1/10 0、引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响就是等同得。A9o引物得5端 a 引物得

21、5端限定着PCR产物得长度,它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰 而不影响扩增得特异性。引物亍端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地 高辛、E u 3 等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变 序列与引入一启动子序列等。必 10、密码子得简并 亠如扩增编码区域，引物3,端不要终止于密码子得第3位,因密码子得第3位易发 生简并，会影响扩增特异性与效率。金 特殊U得得引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物得认识，一些引物得计 算机设讣程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。物序列在模板内应当没有相似性较高尤其就是端相似性较高得序列否则容易导致错配引物端出现个以上得连续碱基如或也会使错误引发机率增加肌引物端得末位碱基对酶得合成效率有较大得影响不同得末位碱基在错配位置导致不同夹结构也可能导致反应失败端序列对影响不太大因此常用来引进修饰位点或标记物引物序列得含量一般为过高或过低都不利于引发反应上下游引物得含量不能相差太大引物对应模板位置序列得值在左右可使复性条件最佳值得计算有相对稳定性应当选用端值较低绝对值不超过而亍端与中间值相对较高得引物引物得端得值过高容易在错配位点形成双链结构并引发聚合反应卩引物二聚体及发夹结构得能值过高超过易导致产生引物二聚体带并且降低引物有效浓度而