WB原理步骤及总结机械制造CAD_机械制造-制造加工工艺.pdf

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1、实验原理蛋口质印迹是把电泳分离的蛋口质转移到固定基质上，然后利用抗原抗 体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS聚丙烯酰胺凝胶 电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去 污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋口质的结合比为1.4:1,山于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质 结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋口质带有相同密度的 负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋口所作的标准曲线，可以求

2、得未知蛋白的相对分 子质量。电泳后蛋口质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶 转移到固定基质上可以对蛋口质进行免疫检测分析。方法有两种：水平半干式 转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电 1030min可完成垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移 装置的缓冲液中，通电24h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚 偏二氟乙烯膜和尼龙膜。蛋口质转移到固定化膜上之后，通过蛋口质染料如丽春红S检测膜上的总蛋口，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探 针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：用非特异性

3、、非反应活性 分子封阻固定化膜上未吸附蛋口的自山结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜 上，出现检测时的高背景固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原 蛋白分子特异性结合酶标二抗与一抗特异结合加入酶底物，适当保温，膜上 便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。主要溶液 10%分离胶 水 3.3mL、30%丙烯酰胺混合液 4.OmL、1.Omol/L Tris(pH8.8)2.5mL、10%SDS 0.ImL、10%过硫酸鞍 0.ImL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶 水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液 0.67mL、1.Omol/L TrisO.5mL、10%SDS0.04M1/1

4、0%过硫酸技 0.04mL、TEMEDO.004mL lXTris-甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱303g、甘氨酸1877g、SDS lg,用去离子水定容至IL 2X SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl(pH6.8)lOOmmol/L,B-疏基乙醇 10%,10%甘油，0.01%漠酚蓝，10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g,甘氨酸U.25g,甲醇lOOmL,加去离子水至IL TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g,Tween-20 1 mL,加去离子水至 IL Stripping 1.3mL Tris(pH 6.8),4mL10%SDS,140 u 1 P-JS基乙醇

5、，用水定容到 20mL 实验步骤 聚丙烯酰胺凝胶电泳1 SDS.凝胶配置 分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻 璃板顶端约2cn）处，停止灌胶。检查是否有气泡，若有用滤纸条吸出。然后在胶 液界面上加蒸憎水进行水封。1530min后，凝胶和水封层界面清晰，说明胶已 经聚合完全，然后用滤纸吸取水封层，滤纸切勿接触到凝胶面。（使蛋白样品分 离）浓缩胶的配置：将配置好的浓缩胶灌注在分离胶之上，直至短玻璃板的顶 端，然后插入样品槽梳子。室温下浓缩胶聚合，约20、30min。（使蛋白样品浓缩）蛋白样品的处理 将蛋白样品溶于样品溶解液，终浓度为0.5lmg/mlo然后转移到小离心

6、管中，轻轻盖上盖子（不能塞紧，以免加热时液体迸岀），在100 C沸水浴中加热3min,取岀冷却后备用，使用前需要将样品离心除去颗粒物质。暂时用不到的话，可放 在20C冰箱长期保存，使用时沸水浴中加热3min,以除去亚稳聚合态物质。上样前的样品一定要均匀以防电泳时出现纵向条带。加样 拔去样品槽梳子，倒入电极缓冲液，没过短板约0.5cm以上,若样品槽中有气泡，用枪头挑除。按顺序向凝胶样品槽中加入标准蛋口和未知蛋口样品，每孔的加样 量要相同，一般加样体积为1030 P1,加样时枪头深入到加样槽内，尽量接近 底部，记录加样顺序。电泳 上槽接负极，下槽接正极，打开直流稳压电源，先80V过了浓缩胶后改为1

7、20V,待澳酚蓝指示剂迁移到凝胶下沿1CID时停止电泳。2蛋白质的电转移 水平半干式电转移 戴乳胶手套剪滤纸6张，滤纸长与宽比SDS-PAGE胶各大lcmo 裁剪与SDSPAGE胶长宽相等的NC膜。将3张滤纸和SDSPAGE胶浸在负极转移液中待用。将另3张滤纸和NC转移膜浸在正极转移液中待用。将浸在负极转移液中的滤纸取出，尽量少带液体，置于转移槽负极上，然后在 负极滤纸上依次铺放SDS-PAGE胶、C膜、3张用正极转移液饱和的滤纸。注意 排除气泡，因为 气泡会产生高阻抗点，形成低效印迹区，即所谓“秃斑 S 盖上石墨阳极板，设定50mA恒流，转移一定时间。垂直湿式转移 凝胶片的平衡：把电泳后的凝

8、胶从玻璃板上转移至成有适量转移缓冲液的大培 养皿中，浸泡3060min,以除去胶中的SDS,使其pH及离子强度和印迹缓冲液相 一致，防止凝胶发生膨胀或皱缩。将转移缓冲液冷却至4 C 准备C膜和滤纸：戴乳胶手套裁剪与凝胶大小相同的NC膜和4张滤纸，用转 移缓冲液浸润膜和滤纸15min,直到没有气泡，将海绵在转移缓冲液中充分浸湿 打开蛋白质转移槽的转移夹，依次放入：浸湿的海绵，两张用转移缓冲液饱和 的滤纸，用转移缓冲液浸过的胶，NC膜，两张用转移缓冲液饱和的滤纸，浸湿 的海绵，然后合上转移夹。膜C转移槽中倒入转移缓冲液，然后将转移夹置于槽中，凝胶靠近负极.靠近正极 将转移槽放到4 C冰箱内，电转移

9、，恒流80 mA,4 h。技术包括三个部分聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质的电泳转移免疫印迹分析聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量是阴离子去污剂能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键使分子去折叠破坏其高级结构与大多数蛋口质的结合的负电荷形似长椭圆棒蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系因此利用相对分子质量准蛋口所作的准曲线可以求得未知蛋白的相对分子质量电泳后蛋口质分子嵌在凝胶介质中探针分子很难通过凝胶孔将蛋白质从凝胶转缓冲液浸湿的滤纸中间通电可完成垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间浸在转移装置的缓冲液中通电或过夜可完成固定基质通常有硝酸纤维素膜聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜蛋口质转移到

10、固定化膜上之后通过蛋口质染料如丽3免疫印迹分析（l）NC膜上总蛋白的染色和脱色：将电泳转移完后的NC膜取出，置于培养皿中。丽春红S染色3min后，用铅笔轻轻标岀标准蛋白带的位置以备计算特异性蛋白 质相对分子质量所需。然后，用丽春红S脱色液轻轻漂洗数次至红色消失。特异性抗体检测 脱色后的丸膜置于培养皿中，加入封闭液，并在水平摇床上不断振摇，室温 下封闭2h以上。（将膜上未结合目的蛋白的区域封闭以防止一抗的结合）倒岀封闭液，加入漂洗液，水平摇床上不断振摇，洗膜3次，每次5mino（除 去封闭液）漂洗完后，将膜转移至杂交袋中，加入特异性一抗，4 C摇床过夜或室温放摇 3h（一抗与目的抗原蛋白特异性结

11、合）利用水平摇床，用TBST洗膜3次，每次5mino（洗去未结合的一抗）将膜转移到稀释的酶标二抗中，在室温下孵育30min 倾去二抗，用TBST洗膜，室温摇洗三次，每次5min,蛋白面朝上，置于保鲜 膜中，将ECL的A液和B液以1:1体积混合，于暗室中，按0.05-0.lml/cm 2的 量滴加于膜表面，孵育lmin,滤纸吸去多余液体用保鲜膜包好，立即于暗室内 曝光数秒。在暗室中，将IX显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X 光片,剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X光片放在膜 上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当 调整曝光时

12、间，一般为lmin或omin,曝光完成后，打开X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间 一般为12min（2025 C）,温度过低时（低于16 C）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5lOmin,以胶片 透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。注意事项 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性；不同浓度的凝胶用于分离不同相对分子质量的蛋白 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价 键、二硫键；对于多亚基蛋口或含多条肽链的蛋口，SDS-PAGE只能测定它们的

13、 亚基或单条肽链的相对分子质量。尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子；蛋白质样品在处理过程中应低温下进行，以避免细胞破碎释放岀各种酶对其进 行修饰 尽量使用新鲜的loading buffer,样品要与loading buffer混合均匀，不可将蛋口质反复冻融使用以防改变蛋口质的抗原特性，Buffer 一定要漫过梳子孔，否则可能会发现蛋口跑不动；电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电圧跑分离胶，特别是对于高分子量的 目的蛋白，硝酸纤维素（NC）膜：NC与蛋口质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质 的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在丸 韧 性较差，易损坏。NC上的小分子蛋

14、口质在洗涤时易丢失；以活化与蛋白质亲和力高，用前需在屮醇中浸泡，聚偏二氟乙烯（PVDF）膜：膜 上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋口结合。但价格上稍贵。为了便于观察 电泳效果和转膜效果，以及判断技术包括三个部分聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质的电泳转移免疫印迹分析聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量是阴离子去污剂能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键使分子去折叠破坏其高级结构与大多数蛋口质的结合的负电荷形似长椭圆棒蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系因此利用相对分子质量准蛋口所作的准曲线可以求得未知蛋白的相对分子质量电泳后蛋口质分子嵌在凝胶介质中探针分子很难通过凝胶孔将蛋白质从凝胶转

15、缓冲液浸湿的滤纸中间通电可完成垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间浸在转移装置的缓冲液中通电或过夜可完成固定基质通常有硝酸纤维素膜聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜蛋口质转移到固定化膜上之后通过蛋口质染料如丽蛋口分子量大小要先将膜晾的屮醇，待完全浸湿 后取出透光观察即可看到蛋白条带（适用20%干，然后浸入（于脱色摇床上摇），然5mino传统方法是将膜用IX丽春红染液染于PVDF膜）后用水冲洗掉没染上 的染液就可看到膜上的蛋白。否则极易避免膜的干燥，从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿，高背景可能的原因：膜未均匀浸泡；膜或缓冲液污染；封 闭产生较高的背景。不充分；抗体与封闭液岀现交义反应；抗体浓

16、度过高。解 决方法有：转膜前用甲醇将膜完全浸泡；杂交前检测一抗、二抗；检测一抗、二 抗与封闭液是否100%有交义反应。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋口质分 子量标准，通常分子量最大的条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春 红染色液对膜进行染色,1-2膜的液对完成转斯亮蓝快速染色效果。也可以用考 马以观察实际的转膜 胶进行染色，以观察蛋口的残留情况。SDS-PAGE 作用分析忖特别是用于蛋口质纯度检测和测定蛋口质分子量，定性分析蛋 白质，的蛋白表达的特异性。蛋白样品的制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放 置一会儿使残余培

17、养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加3ml4 C预冷的PBS（0.01MpH7.27.3）。平放轻轻摇动lmin 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、按lml裂解液加10 nl PMSF（100mM）,摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至 无结晶时才可与裂解液混合。）4、每瓶细胞加400 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min,为使细胞充 分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用 枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、

18、于4 C下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移到离心管中放于一20 C保存。（2）组织中总蛋白的提取：1、将少量组织块置于12ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽 量剪碎。2、加400 U1单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后 置于冰上。几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。、3.4、裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4 C 下12000rpm离心5mim 取上清分装于0.5ml离心管中并置于一20保存 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取 山于受药物的影响，一些细胞脱落下来

19、，除了按（一）操作外还应集培养液中的 细胞。培养液中细胞总蛋白的提取 将培养液倒15m离心管中，2500rp离5mi 弃上清，力口 4ml PB并用枪轻轻吹打洗涤，然2500rp离5mi。弃上清后PB重复 洗涤一次 用枪洗干上清后，100裂解液（PHS）冰上裂30mi裂解过程中要经常弹一弹以使 细技术包括三个部分聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质的电泳转移免疫印迹分析聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量是阴离子去污剂能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键使分子去折叠破坏其高级结构与大多数蛋口质的结合的负电荷形似长椭圆棒蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系因此利用相对分子质量准蛋口所作的准

20、曲线可以求得未知蛋白的相对分子质量电泳后蛋口质分子嵌在凝胶介质中探针分子很难通过凝胶孔将蛋白质从凝胶转缓冲液浸湿的滤纸中间通电可完成垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间浸在转移装置的缓冲液中通电或过夜可完成固定基质通常有硝酸纤维素膜聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜蛋口质转移到固定化膜上之后通过蛋口质染料如丽胞充分裂解 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一 4 C12000rp离5mi,上清分装0.5m离心管中 并置于一20C保存（三蛋口含量的测 制作标准曲 从一20 C取lmg/ml BS,室温融化后，备用 11.5m 离心管个一组分别标记 0m2.5m5.OmlO.0m20.0m40.0m 按下表在各

21、管中加入各种试剂 0 10.0m20.OmlO.0m 2.5mg 5.Omg g g g mg 40.0m20.OmlO.Omlmg/ml BSA 2.5ml 5.0ml 111 95.0m97.5m60.0m90.0ml00m80.OmO.15mol/L NaCl 111111 考马斯亮蓝溶G2501ml lml lml lml lml lml 液.4、混匀后，室温放置2mino在生物分光光度计上比色分析。（2）检测样品蛋白含量 1、取若干1.5ml离心管，每管加入4 C储存的考马斯亮蓝溶液lml。室温放 置30min后即可用于测蛋口。2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液1

22、00 ml,混匀放置2分钟可做 为空口样品，将空口倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样 品。），再用无次（每次0.5ml弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2 3、菌水洗 一次。待测5ml取一管考马斯亮蓝加95 mlO.15mol/L NaCl NaCl溶液和4、键测样品。2min,倒入扣干的比色杯中按sample蛋白样品，混匀后静置次，无菌水洗2注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗 一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多 时间。测得的结果是5 ml样品含的蛋口量。主要参考 生物化学实验教程 刘箭主编 分子生物学实验指导魏群主编 还有白度上搜

23、的关于wb的方法步骤及试验中出现的问题 热致相分离法的英文缩写TIPS,是Thermally Induced Phase Separation的简称原理是在聚合物的熔点以上，将聚合物洛于高沸点，低挥发 性的溶剂（乂称稀释剂）中，形成均相洛液。然后降温冷却。在冷却过程中，体 系会发生相分离。这个过程分两类，一类是固一液相分离（简称S-L相分离），一类是液一液相分离（L-L相分离）。控制适当的工艺条件，在分相之后，体系 形成以聚合物为连续相，洛剂为分散相的两相结构。这时再选择适当的挥发性试 剂（即萃取剂）把溶剂萃取出来，从而获得一定结构形状的聚合物微孔膜。与 NIPS法相技术包括三个部分聚丙烯酰胺

24、凝胶电泳蛋白质的电泳转移免疫印迹分析聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量是阴离子去污剂能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键使分子去折叠破坏其高级结构与大多数蛋口质的结合的负电荷形似长椭圆棒蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系因此利用相对分子质量准蛋口所作的准曲线可以求得未知蛋白的相对分子质量电泳后蛋口质分子嵌在凝胶介质中探针分子很难通过凝胶孔将蛋白质从凝胶转缓冲液浸湿的滤纸中间通电可完成垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间浸在转移装置的缓冲液中通电或过夜可完成固定基质通常有硝酸纤维素膜聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜蛋口质转移到固定化膜上之后通过蛋口质染料如丽比,TIPS有许多优

25、点：它通过较为迅速的热交换促使高分子溶液分相，而不是缓慢的溶剂一非溶剂交换；TIPS法避免了 NIPS法（非溶剂致相分离法）山于存在溶剂一非溶剂交换，导致成膜液中部分洛剂参与了聚合物的凝胶化，所 以孔隙率低的缺点；TIPS法可用于难以采用NIPS法制备的结晶性聚合物微孔滤 膜的制备，而且TIFS法的影响因素要比FS法少，更容易控制:III TIPS法可 获得多种微观结构，如开孔，闭孔，各同向性，各异向性，非对称等。热致相分离制膜步骤2 技术包括三个部分聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质的电泳转移免疫印迹分析聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量是阴离子去污剂能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键使分子去折叠破坏其高级结构与大多数蛋口质的结合的负电荷形似长椭圆棒蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系因此利用相对分子质量准蛋口所作的准曲线可以求得未知蛋白的相对分子质量电泳后蛋口质分子嵌在凝胶介质中探针分子很难通过凝胶孔将蛋白质从凝胶转缓冲液浸湿的滤纸中间通电可完成垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间浸在转移装置的缓冲液中通电或过夜可完成固定基质通常有硝酸纤维素膜聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜蛋口质转移到固定化膜上之后通过蛋口质染料如丽