双缩脲法测定蛋白质含量高等教育生物学_高等教育-生物学.pdf

《双缩脲法测定蛋白质含量高等教育生物学_高等教育-生物学.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《双缩脲法测定蛋白质含量高等教育生物学_高等教育-生物学.pdf（3页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 仅供个人参考 实验二十 蛋白质含量测定双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的 学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。二、实验原理 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红 色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(CO-NH2)，或与此相似的基团 如 CH2-NH2，CS-NH2，C(NH)NH2 的任何 化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(CO-NH)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定

2、范围为 110mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。三、实验试剂和器材 试剂 1双缩脲试剂：取 CuSO4 5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加 2.5mol L NaOH 溶液 300ml，KI 1.0g，然后加水至 1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。2标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成

3、 10g/L 的标准蛋白溶液，可用 BSA 浓度 1g/L 的 A280 为 0.66 来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出 其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl 配制，酪蛋白用 0.05mol/L NaOH 配制。器材 1试管：15150mm 试管 7 只；21ml，5ml 移液管；不得用于商业用途 仅供个人参考 3坐标纸；4721 分光光度计。四、实验操作 取试管 7 支，编号，按下表操作：试剂 空白管 1 2 3 4 5 测定管 管号 蛋白标准-0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 液（

4、10g/L）生理盐水 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1-0.4 待测样品-0.1 双缩脲试 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 剂 相当蛋白 0 10 20 30 40 50-质（g/L）混匀，37水浴 20 分钟，冷却至室温，在分光光度计波长 540nm 处，用空 白管调零，读取各管吸光度值。1 5 为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。以测定管的吸光度，在标准曲线 上求得蛋白质浓度。注意事项 1双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠，Cu2+形成稳定的络合铜离子，以防止 CuSO4 5H20 不稳定形成 Cu(OH)2 沉淀。酒石酸

5、钾钠与 CuSO4 5H20 之比不低于 3 1，加入 KI 作为抗氧化试剂。2双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳。3本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。4黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰。思考题 1双缩脲法测定蛋白质的原理是什么?其它还有什么方法测定蛋白质的含量?2请用双缩脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法(除标准曲线法外)。不得用于商业用途 量的原理和方法二实验原理在碱性溶液中双缩脲与二价铜离子作用形成紫红色的络合物这一反应称双缩脲反应凡分子中含二个或二个以上酰胺基或与此相似的基团如的任何化合物无论这类基团直接相连还是通过一

6、个碳或氮原子间接蛋白质含量成正比可用比色法测定蛋白含量测定范围为蛋白质干扰这一测定的物质主要有硫酸铵缓冲液和某些氨基酸此法的优点是较快速不同的蛋白质产生颜色的深浅相近以及干扰物质少主要的缺点是灵敏度差因此双缩脲法常用于溶液然后加水至棕色瓶中避光保存长期放置后若有暗红色沉淀出现即不能使用标准蛋白质溶液用标准的结晶牛血清清蛋白或标准酪蛋白配制成的标准蛋白溶液可用浓度的为来校正其纯度如有需要标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮 仅供个人参考 仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途。For personal use only in study and research;not for commercia

7、l use.Nur f r den pers?nlichen f r Studien,Forschung,zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l tude et la recherche uniquement des fins personnelles;pas des fins commerciales.,.以下无正文 不得用于商业用途 量的原理和方法二实验原理在碱性溶液中双缩脲与二价铜离子作用形成紫红色的络合物这一反应称双缩脲反应凡分子中含二个或二个以上酰胺基或与此相似的基团如的任何化合物无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接蛋白质含量成正比可用比色法测定蛋白含量测定范围为蛋白质干扰这一测定的物质主要有硫酸铵缓冲液和某些氨基酸此法的优点是较快速不同的蛋白质产生颜色的深浅相近以及干扰物质少主要的缺点是灵敏度差因此双缩脲法常用于溶液然后加水至棕色瓶中避光保存长期放置后若有暗红色沉淀出现即不能使用标准蛋白质溶液用标准的结晶牛血清清蛋白或标准酪蛋白配制成的标准蛋白溶液可用浓度的为来校正其纯度如有需要标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮