基因工程原理高等教育生物学_高等教育-生物学.pdf

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1、基因工程原理 内容提要 1.基因工程又称基因操作、重组 DNA 技术,是 P.Berg等于 1972 年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”。该技术有两个基本的特点分子水平上的操作和细胞水平上的表达。2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA 连接酶和其他一些参与 DNA 合成与修饰的酶类。3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类。类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切,作用时需要 Mg+作辅助因子,但不需要 ATP和 SAM。第一个被分

2、离的类酶是 Hind。4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有 DNA 连接酶和 RNA 连接酶之分。基因工程中使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA 连接酶连接酶和T4-DNA 连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从 T4噬菌体感染的中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的 DNA分子，有三种主要类型质粒 DNA、病毒 DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。6.DNA 重组连接的方法大致分为四种:粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连

3、接法。粘性末端连接法是最常用的 DNA 连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链 DNA 分子在 DNA 连接酶的作用下,连接成为一个杂合双链 DNA。平末端连接是指在 T4 DNA连接酶的作用下,将两个具有平末端的双链 DNA分子连接成杂种 DNA分子。同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链 DNA的 3 端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工粘性末端,外源 DNA 和载体 DNA 分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如 dA(dG)和dT(dC),然后在 DNA 连接酶的作用下,连接成为重组的 DNA。这种方法可适用于任何来源的 DNA 片段,但方法较繁,需要核酸外切酶、S1 核酶、末端转

4、移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段 DNA 分子(在这一小段 DNA 分子上有某种限制性内切酶的识别序列),加到载体或外源 DNA的分子上,然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。7.基因文库分为基因组文库、cDNA文库等，是指在一种载体群体中,随机地收集着某一生物 DNA的各种克隆片段,理想地包含着该物种的全部遗传信息。8.DNA 重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是 CaCl2 法（图 3-20），此外也可以用基因枪等方法

5、转化外源 DNA。9.重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等。10.基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景，并形成了一大批生物技术产业。基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种 DNA 分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品；或是研究基因的结构和功能，揭示生命活动规律。基因工程技术诞生于 20 世纪 70 年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大飞跃，证明并实现了基因的可操作性，使人类从

6、简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源的时代。基因工程技术诞生至今已经取得了辉煌的成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注目的前沿学科之一，基因工程也是当今新的产业革命的一个重要组成部分。第一节 基因工程技术的诞生 基因工程又称基因操作(gene manipulation),重组 DNA(recombinant DNA)技术,是 70 年代发展起来的遗传学的一个分支学科。一、基因工程技术的诞生 1972 年，P.Berg 等在 PNAS上发表了题为“将新的遗传信息插入 SV40病毒 DNA 的生物化学方法:含有 噬菌体基因和 半乳糖操纵子的环状 SV40DNA

7、”，标志着基因工程技术的诞生。SV40 病毒是猿猴病毒，是一种直径为450 的球形病毒，分子量为 28106 道尔顿。SV40的 DNA 是环状双链结构，全长 5243 个碱基对，编码三个衣壳蛋白 VP1、VP2、VP3和一个 T抗原。SV40DNA 上有一个限制性内切酶的切点。Berg 等首先用化学方法构建了一个二聚体的环状 SV40DNA(图 3-1)。图 3-1 重组的 SV40二聚体的构建(引自 Berg et.al,1972)当时所用的连接方法是同聚物谱尾法，重组体的鉴定主要是通过电子显微镜比较分子量大小。当获得二聚体 SV40DNA 后，Berg 等就证明了环状 DNA 被内切酶切

8、成线性 DNA 后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。于是他们进行第二步的实验就是从 dvgal DNA 中制备含有 的半乳糖操纵子DNA，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功。Berg 等的工作是人类第一次在体外给遗传物质动手术，标志着一个新时代的到来，为此他获得了 1980 年诺贝尔化学奖。二、基因操作的基本过程 和特点 基因工程的操作可用图 3-2 表示 图 3-2 基因工程的基本过程(引自 Old&Primrose,1980)它所涉及的过程可用“分(合成)、切、连、转、选、鉴”六个字表示。分(合成)指 DNA 的制备，包括从生物体中分离或人工合成。分离制备或合成制备 DNA 的

9、方法都有很多种。切即在体外将 DNA 进行切割，使之片段化或线性化。连即在体外将不同来源的 DNA 分子重新连接起来，构建重组 DNA 分子。转即将重组连接的 DNA 分子通过一定的方法重新送入或细胞中进行扩增和表达。选从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；鉴就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定，因为有些重组体并非是所需要的，必需通过分析鉴定。基因工程有两个基本的特点分子水平上的操作和细胞水平上的表达。遗传重组是生物进化的推动力，自然界中发生的遗传重组主要是靠有性生殖。基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作，构建在生物体内难以进行的重组，然后将重组的遗传物质引入相应的宿主

10、细胞，让其在宿主细胞中进行工作。这实际上是进行无性繁殖，即克隆，所以基因工程通常有称为基因克隆。第二节 限制性内切核酸酶 外科医生给患者动手术需要手术刀，基因工程师们给 DNA 分子(基因)动手术需要分子手术刀，这就是工具酶。基因工程中使用的工具酶很多，包括限制性内切核酸酶、DNA 连接酶和其他一些参与 DNA 合成与修饰的酶类，最重要的是限制性内切核酸酶。基因工程上把那些具有识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链结构的核酸内切酶统称为限制性内切核酸酶。一、限制性内切核酸酶的发现 1952 年 Luria、Human在 T偶数噬菌体、1953 年 weigle、

11、Bertani在 噬菌体对大肠杆菌的感染实验中发现了细菌的限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深入研究，导致限制性内切核酸酶的发现。噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的能力，取决于它最终在其中繁殖的细菌是什么菌株。例如，将 A噬菌体从一株大肠杆菌转移到另外一株，其生长效率往往会削弱，对这两个菌株的滴 定度可差好几个数量级。第二个菌株释放的噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染原来的宿主菌，再将释放的子代噬菌体重新感染第二个菌株时，感染率要大大下降。此种现象即为宿主控制的限制作用(host Controlled restriction)。选该技术有两个基本的特点分子水平上的操作和细胞水

12、平上的表达基因工程中使用多种工具酶包括限制性内切核酸酶连接酶和其他一些参与合成与修饰的酶类限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶属于水解酶类根据限制性割的方式有平切和交错切作用时需要作辅助因子但不需要和第一个被分离的类酶是连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶有连接酶和连接酶之分基因工程中使用的连接酶来自于原核生物有两种类型的连接酶连接酶进行平末端连接载体是能将分离或合成的基因导入细胞的分子有三种主要类型质粒病毒科斯质粒在这三种类型的基础上根据不同的目的出现了各种类型的改造载体重组连接的方法大致分为四种粘性末端连接平末端连接同聚物接尾连用放射性同位素标记的噬菌体进行的实验结果表

13、明，在受感染的宿主细胞中，噬菌体生长的限制伴有噬菌体 DNA 的迅速降解，然而，用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类似的噬菌体 DNA 的降解。如果某一细菌细胞具有一种能选择性降解来自侵染病毒(或其他来源)的核酸酶，那么，它必须能将这种外来 DNA 同它自己的 DNA 区分开来，之所以能够如此，乃是通过稍 为宿主控制的修饰作用(host-controlled modification)。因此，限制(restriction)作用是指细菌的限制性核酸酶对 DNA 的分解作用，限制一般是指对外源 DNA 侵入的限制。修饰(modification)作用是指细菌的修饰酶对于 DNA 碱基结构改变的作

14、用(如甲基化)，经修饰酶作用后的 DNA 可免遭其自身所具有的限制酶的分解。到 20 世纪 60 年代中期，科学家推测细菌中有限制修饰系统(restrictionmodification system R-M system)。该系统中有作用于同一 DNA 的两种酶，即分解 DNA 的限制酶和改变 DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作用于同一 DNA 的相同部位。一般说来，不同种的细菌或不同种的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制-修饰系统。1968 年，Meselson 从 Ecoli K株中分离出了第一个限制酶 EcoK，同年 Linn 和 Aeber 从 Ec

15、oli B株中分离到限制酶 EcoB。遗憾的是，由于 EcoK和 EcoB这两种酶的识别和切割位点不够专一，在基因工程中意义不大。1970 年，Smith 和 Wilcox 从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶，能够特异性地切割 DNA，这个酶后来命名为Hind，这是第一个分离到的类限制性内切核酸酶。由于这类酶的识别序列和切割位点特异性很强，对于分离特定的 DNA 片段就具有特别的意义。二、限制性内切核酸酶的命名和分类（一）限制性内切核酸酶的命名 按照国际命名法，限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶的数量众多，而且越来越多，并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆，1973 年 Smith

16、 和 Nathans 对内切酶的命名提出建议，1980 年，Roberts 对限制性酶的命名进行分类和系统化。限制性酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的个一个首字母，再加上序号，将限制性内切核酸酶的命名要点列于表 3-1。表 3-1 限制性内切核酸酶的命名要点 条目 要点 基本原则 3-4 个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号 首字母 取属名的第一个字母,且大写 第二字母 取种名的第一个字母,小写 第三字母 取种名的第二个字母,小写;若种名有词头,且已命名过内切酶,则取词头后的第一字母代替 第四字母 若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定 顺序号 若在同一菌

17、株中分离了几个限制性内切核酸酶,则按先后顺序冠以 I、II、III,.等 如:EcoK:Escherichia coli K(大肠杆菌 K株)（二）限制性内切核酸酶的分类 限制性内切核酸酶的作用特点，将它们分为三大类。1.I类限制性内切核酸酶 I 类限制性内切核酸酶的分子量较大,一般在30万道尔顿以上,通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性酶EcoB是由 R(135kD)，M(62kD)和 S(55kD)三种亚基组成的复合酶，这三个亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为 449kD,共 5 个亚基，其中 R亚基和 M亚基各两分子。类酶不仅是一种核酸内切酶,同时在酶分子上还具有甲基化酶和 A

18、TPase 的活性，所以是具有多种酶活性的复合酶类。作用时除了需要 Mg+作辅助因子外,还要求 ATP和S 腺苷甲硫氨酸(SAM)的存在。类酶具有特异的识别序列，大约 15 个碱基对。类酶虽然能够在一定序列上识别DNA 分子,并能同DNA 分子作用,因其识别DNA 后,要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为1000个碱基左右)，并且要形成一个环才能切割DNA(图3-3),所以识别位点和切割位点不一致，产生的片段较大。图 3-3 I 类酶的作用方式(引自 Lewin,1997)选该技术有两个基本的特点分子水平上的操作和细胞水平上的表达基因工程中使用多种工具酶包括限制性内切核酸酶连接酶和其他一

19、些参与合成与修饰的酶类限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶属于水解酶类根据限制性割的方式有平切和交错切作用时需要作辅助因子但不需要和第一个被分离的类酶是连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶有连接酶和连接酶之分基因工程中使用的连接酶来自于原核生物有两种类型的连接酶连接酶进行平末端连接载体是能将分离或合成的基因导入细胞的分子有三种主要类型质粒病毒科斯质粒在这三种类型的基础上根据不同的目的出现了各种类型的改造载体重组连接的方法大致分为四种粘性末端连接平末端连接同聚物接尾连2.类限制性内切核酸酶 类限制性内切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亚基组成类似于类酶,作用方式基本同

20、类酶。如EcoP1是由两个亚基组成，一个亚基(M 亚基)负责位点识别和修饰。另一个亚基(R 亚基)具有核酸酶的活性(图 3-5)。切割 DNA 时需要 ATP,Mg2+,也能被 SAM激活，但并非必需。图 3-4 类限制性内切核酸酶(引自 Lewin,1997)3.类限制性内切核酸酶 这类酶的分子量较小.一般在 2-4 万道尔顿,通常由 2-4 个相同的亚基所组成。它们的作用底物为双链 DNA,极少数类酶也可作用于单链 DNA,或 DNA/RNA 杂种双链。这类酶的专一性强,它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求,而且对更远的碱基也有要求,因此,类酶既具有切割位点的专一性,也具有识别位点的专一

21、性,一般在识别序列内切割。切割的方式有平切和交错切,产生平末端的 DNA 片段或具有突出粘性末端的 DNA 片段(5 或 3 粘性末端)。作用时需要 Mg+作辅助因子,但不需要 ATP和 SAM。类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发现有什么关系,第一个被分离的类酶是Hind。三.类限制性内切核酸酶的性质 1.识别序列的特异性 在 3 类限制性内切核酸酶中，类限制性内切核酸酶的特异性最强。大多数类限制性内切核酸酶识别的序列是回文序列。如 BamHI和 BglI 都是识别六个碱基的 DNA 序列(图 3-5)，都是完全的回文序列。这段序列有两个基本的特征，第一是能够中在间划一个对称轴，两侧的序列

22、两两对称互补配对，第二个特点是两条互补链的 5到 3的序列组成相同，即将一条链旋转 1800，则两条链重叠。图 3-5 类限制性内切核酸酶识别的回文序列（引自&Vote）2.限制性内切核酸酶的切割频率与速度 切割频率是指限制性内切核酸酶在某 DNA 分子中预测的切点数。由于 DNA 是由四种类型的单核苷酸组成，假定 DNA的碱基组成是均以的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，那么对于任何一种限制性内切核酸酶的切割频率，理论上应为 1/4n，n 表示该限制性内切核酸酶识别的碱基数。如识别 4 个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每 256 个碱基有一个识别序列和切点(1/44=1/2

23、56)，识别 5 个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每 1024 个碱基有一个识别序列和切点，余下类推。实际上因 DNA 的分布是不均一的,且有大量的重复序列,加上内切酶的切点具有 GC倾向,所以实际的频率偏低。如同是识别 6 个碱基的限制性内切核酸酶，切割的频率相差很大EcoRI 4000;BamHI:6000;SalI:8000;HpaII:200。根据限制性内切酶切割 DNA 所产生的产物末端，发现限制性内切酶对 DNA 的切割有两种方式，即平切和交错切。所谓平切，就是限制性内切酶在 DNA 双链的相同位置切割 DNA 分子，这样产生的末端就是平末端。交错切就是限制性内切酶在 DN

24、A 双链的不同位置切割 DNA，产生的 DNA 片段的末端不是平齐的(图 3-6)。图 3-6 平末端与黏性末端(Hartl,1991)类限制性内切酶的切割产物有平末端和粘性末端(cohesive end)。粘性末端是指 DNA 分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分,这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对,形成双链。并在 DNA 连接酶的作用下,使同一 DNA 分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。不同限制性内切酶切割 DNA 产生的三种不同类型的末端(表 3-3)。表 3-3 某些限制性内切酶及产生的末端 5-

25、粘性末端 3 粘性末端 平末端 酶 识别序列 酶 识别序列 酶 识别序列 Taq I T/CGA Pst I CTGCA/G Alu I AG/CT Cla I AT/CGAT Sac I GAGCT/C FnuD CG/CG Mbo I /GATC Sph I GCATG/C Dpn I GA/TC Bgl A/GATCT Bde I GGCGC/C Hae GG/CC BamHI G/GATCC Apa I GGGCC/C Pvu CAG/CTG Bcl I T/GATCA Kpn I GGTAC/C Sma I CCC/GGC Hind A/AGCTT Nae I GCC/GGC 选该技

26、术有两个基本的特点分子水平上的操作和细胞水平上的表达基因工程中使用多种工具酶包括限制性内切核酸酶连接酶和其他一些参与合成与修饰的酶类限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶属于水解酶类根据限制性割的方式有平切和交错切作用时需要作辅助因子但不需要和第一个被分离的类酶是连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶有连接酶和连接酶之分基因工程中使用的连接酶来自于原核生物有两种类型的连接酶连接酶进行平末端连接载体是能将分离或合成的基因导入细胞的分子有三种主要类型质粒病毒科斯质粒在这三种类型的基础上根据不同的目的出现了各种类型的改造载体重组连接的方法大致分为四种粘性末端连接平末端连接同聚物接尾连

27、Nco I C/CATGG Hpa I GTT/AAC Xma I C/CCGGG Nru I TCG/CGA Xho I C/TCGAG Bal I TGG/CCA EcoR I G/AATTC Mst I TGC/GCA Sal I G/TCGAC Mha TTT/AAA Xba I T/CTAGA EcoR GAT/ATC 基因的分子手术是相当复杂的过程，除了需要限制性内切酶外，还需要其他一些工具酶包括连接酶、DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、核酸酶、末端修饰酶等，对 DNA 或 RNA 进行各种各样的修饰。其中最重要的是连接酶。第三节 基因工程载体 载体(vector,vehicle)的

28、本意就是媒介体，基因工程上的载体是能将分离或合成的基因导入细胞的 DNA 分子，称为克隆载体。基因工程中有三种主要类型的载体质粒 DNA、病毒 DNA、科斯质粒，其中质粒 DNA 是最常用的载体，但运载能力低，柯斯质粒是质粒和 噬菌体 DNA 的结合体，运载能力最高(图 3-7)。在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。图 3-7 三种类型的载体(引自 Greene,1998)一、质粒载体 质粒(plasmid)是染色体以外的遗传物质，它是双链闭合环状 DNA 分子，其大小可从 1kb 到 200kb 左右，能够在宿主内利用宿主的酶系统进行复制。质粒是基因工程的主要载体

29、。(一)质粒概念 19461947 年间，Lederberg 和 Tatum 发现了细菌的接合现象，这是细菌的有性繁殖方式。此后不久，便弄清了这种接合是两种不同的交配型(接合型)，遗传信息总是从供体(雄性)转移到 受体(雌性)。当两种不同的交配型的细菌相互识别和接合以后，雄性细胞的致育因子，通过细胞的表面结构传递到雌性细胞，这种致育因子后来称为 F因子。1952 年，Lederberg 指出，细菌的 F因子与高等生物细胞质中染色体外的遗传单元极为相似，并正式提出了“质粒”这一名称，以区别于染色体的遗传单元。一般来讲，质粒是细胞中能够独立复制的复制子，并在细胞分裂时能稳定传递给子代细胞。虽然质粒

30、对细胞的生存没有影响，但质粒 DNA 上也有一些编码基因，赋予宿主细胞一些特性。自发现能赋予细菌性别特征的 F因子以后，又在大肠杆菌中发现了一种能够编码抗菌物质大肠杆菌素的 Col 质粒，包括 ColB，ColV，ColE 等。由这些因子产生的抗菌物质称细菌素(bacleriocin)，是细菌所合成的一种蛋白质，对于同种或近缘种具有毒性。合成细菌素的能力和对于细菌素的抗性，都由染色体外的遗传因子所控制。在 1959 一 1960 年间，日本科学家在研究用强效抗生素治疗菌痢患者时，发现病原菌志贺氏 菌含有使其同时能抗几种抗生素的基因，而且，这种抗药性基因能以和 F因子非常相似的方式 转移给其他肠

31、道细菌，这就是抗药因子(R 因子)。抗药因子(resistance factor)实际上是控制细菌抗药性的一种质粒，能在细菌间转移，由抗药性转移因子和抗药性基因两部分组成。每个抗药因子上常具有几个抗药性基因。（二）质粒 DNA 的基本性质 大多数质粒 DNA 是是环状双链的 DNA 分子。如果两条链都是完整的环，这种质粒 DNA 分子称为共价闭合环状DNA(covalently closed circular,CCC DNA)。CCC DNA 有两种构型，超螺旋 DNA(supercolied DNA，SC DNA)和松弛的 DNA(Relaxed DNA),分别是由 DNA 促旋酶(DNA

32、gyrase)和拓朴异构酶(topoisomerase)作用的结果。如果质粒 DNA 中有一条链是不完整的，那么这种 DNA 分子就称为开环的(open circles,OC DNA)，开环的 DNA 通常是由内切酶或机械剪切造成的图 3-8)。从细胞中分离质粒 DNA 时，质粒 DNA 常常会转变成超螺旋的构型。图 3-8 质粒 DNA 的三种构型(引自 Old&Primrose,1980)溴化乙啶(ethidium bromide，EtBr)是一种扁平的分子，能够插入到 DNA 分子的碱基对之间，引起双螺旋的部分解旋，从而改变了 DNA 的体积和密度。图 3-9 相对分子质量相同构型 不同

33、的质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 选该技术有两个基本的特点分子水平上的操作和细胞水平上的表达基因工程中使用多种工具酶包括限制性内切核酸酶连接酶和其他一些参与合成与修饰的酶类限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶属于水解酶类根据限制性割的方式有平切和交错切作用时需要作辅助因子但不需要和第一个被分离的类酶是连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶有连接酶和连接酶之分基因工程中使用的连接酶来自于原核生物有两种类型的连接酶连接酶进行平末端连接载体是能将分离或合成的基因导入细胞的分子有三种主要类型质粒病毒科斯质粒在这三种类型的基础上根据不同的目的出现了各种类型的改造载体重组连接的方法大致分

34、为四种粘性末端连接平末端连接同聚物接尾连（引自 Old&Primrose,1980）由于不同构型的 DNA 插入 EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，CCC DNA 的泳动速度最快，OC DNA泳动速度最慢，L DNA居中(图 3-9)，所以很容易通过凝胶电泳和 EB染色的方法将不同构型的 DNA 分别开来。（三）质粒分类 根据质粒的拷贝数将质粒分为松弛型质粒和严紧型质粒。质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单一质粒的份数同染色体数之比值,常用质粒数/每染色体来表示。不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同,松弛型质粒(relaxed plasmid)的复

35、制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数。通常可达 1015 个/每染色体。并且可以在氯霉素作用下进行扩增，有的质粒扩增后，可达到 3000/每染色体(ColE1,可由 24 个达到 1000 至 3000 个)。这类质粒多半是分子量较小,不具传递能力的质粒。基因工程中使用的多是松弛型质粒。严紧型质粒(stringent plasmid)在寄主细胞内的复制除了受本身的复制机构的控制外，还受染色体的严紧控制，因此拷贝数较少，一般只有 12 个/每染色体。这种质粒一般不能用氯霉素进行扩增。严紧型质粒多数是具有自我传递能力的大质粒。质粒的复制特性是受复制子控制的。基

36、因工程中使用的质粒多数是松弛性质粒载体。（四）载体的条件 就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分(图 3-10)复制区，含有复制起点；选择标记，主要是抗性基因；克隆位点，便于外源 DNA 的插入。就复制特性来讲，要求载体必需有独立的复制起点,最好是松弛型复制，这样便于得到大量的拷贝。有时需要有多个复制起点，能够在不同的宿主细胞中复制，扩大宿主范围。具有合适的克隆位点,便于外源 DNA 的插入。克隆位点实际上限制性酶切位点，最好是具有多种限制性内切酶的单切点，这样适应性强，克隆方便，如果一种酶在载体上有多个切点，就会限制该切点的使用。具有可检测的选择标记,也是一个重

37、要的基本条件，这种选择标记最好是能够赋予宿主易于检测的表型。选择标记就是常说的报告基因(report genes)，包括抗生素抗性标记，以及一些生化表型的标记。另外，一个理想的质粒载体必需具有低分子量，因为小分子的质粒 DNA 易于操作，不容易被损伤，也容易被分离纯化。一般说小分子量的质粒分子的拷贝数比较高，酶切位点也少。图 3-10 质粒载体的基本结构 二、杂合载体 除了质粒载体外，噬菌体的 DNA 也可作为载体，不过都是改造过的，自然病毒的 DNA 不能作为载体。目前在基因工程中使用的载体大多是质粒和噬菌体的杂合载体。（一）柯斯质粒(cosmid)载体 cosmid 是英文 cos sit

38、e-carrying plasmid 的缩写,本意是带有粘性末端位点的质粒,因此,柯斯质粒是人工建造的的含有 DNA 的 cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯斯质粒的构建一般都是利用质粒的复制子、选择标记,加上 的 cos 位点序列及与包装有关的序列，构建的科斯质粒可以很好地用于基因克隆(图 3-11)。图 3-11 柯斯质粒载体克隆(引自 Lodish et al,1986)早期构建的科斯质粒载体有一些不足，如克隆位点较少，抗性标记单一，容栽能力不大，后来进行了一些改进，克服了这些不足。柯斯质粒具有如下特点:1.具有质粒复制子。目前构建的柯斯质粒大多具有 pMB1复制子或 Col

39、E1 复制子,所以进入寄主细胞后能够象质粒一样进行复制,并且能够被氯霉素扩增。2.具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记。如果在这些标记中有克隆位点的话可用插入失活法进行筛选。例如上面构建的 MuA-3 就具有四环素抗性基因。3.具有 噬菌体的包装和转导特性。由于柯斯质粒具有 DNA 的 cos 位点和相应的包装序列,因此在克隆了适当大小的外源 DNA 以后可以被包装进入噬菌体蛋白颗粒,并能进行转染。转导的能力比纯的质粒大 3 个选该技术有两个基本的特点分子水平上的操作和细胞水平上的表达基因工程中使用多种工具酶包括限制性内切核酸酶连接酶和其他一些参与合成与修饰的酶类限制性内切核酸酶是基因工程中

40、最重要的工具酶属于水解酶类根据限制性割的方式有平切和交错切作用时需要作辅助因子但不需要和第一个被分离的类酶是连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶有连接酶和连接酶之分基因工程中使用的连接酶来自于原核生物有两种类型的连接酶连接酶进行平末端连接载体是能将分离或合成的基因导入细胞的分子有三种主要类型质粒病毒科斯质粒在这三种类型的基础上根据不同的目的出现了各种类型的改造载体重组连接的方法大致分为四种粘性末端连接平末端连接同聚物接尾连数量级。进入寄主细胞后,又可以自我环化。但它不能同寄主的染色体 DNA 整合,也不会产生子代噬菌体裂解寄主。4.溶载能力大。这是柯斯质粒的最大优点。被克隆的 D

41、NA 大小具有上限和下限,这是因为柯斯质粒最后是被包装到噬菌体颗粒,它的最后大小应在噬菌体基因组的 75%-105%之间。由于载体分子一般在 5kb 左右,所以克隆的最大片段在 45kb;如果载体的分子量为 15kb 的话,克隆的最小片段为 19kb。因此柯斯质粒适合构建真核生物的基因库,而不适合克隆原核生物的基因。（二）pUC载体系列的构建 美国加州大学的 Vieira和 Messing 利用 pBR322和 M13载体的优点，构建了一个更小的载体，称为 pUC7（图 3-12），并在此基础上发展了 pUC载体系列。图 3-12 pUC 载体的构建(引自 Winnacker,1987)pUC

42、载体具有很多优点多克隆位点；松弛复制；有氨苄青酶素抗性；可通过化学显色筛选。现在最常用的 pUC载体是 pUC18(图 3-13),它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制，在正常情况下，它的拷贝数可达上千个，所以不需要用氯霉素进行扩增。图 3-13 pUC18质粒载体图谱 二、基因文库技术 基因文库(Gene Library)是指在一种载体群体中,随机地收集着某一生物 DNA 的各种克隆片段,理想地包含着该物种的全部遗传信息(图 3-18)。因此,基因文库是人工构建的某一生物基因的“活期储蓄所”,根据构建方法的不同,分为基因组文库、cDNA文库等。根据基因库的含量,

43、又分为全库和特异性的库,全库含有某一生物的全部遗传信息,而特异性的库是不完整的,如差示库。早期将通过构建基因文库来筛选所需克隆的方法称为鸟枪法。图 3-18 基因文库技术（&Rao.,1998）第三节 体外重组 一、体外重组的方法 DNA 重组连接的方法大致分为四种:粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。1.粘性末端连接法 粘性末端连接(Cohesive end ligation)是指具有相同粘性末端的两个双链 DNA 分子在 DNA 连接酶的作用下,连接成为一个杂合双链 DNA(图 3-14)。粘性末端可由识别回文序列的内切酶所产生,或是用末端转移酶来制备。凡是识别回文序列的

44、内切酶切割 DNA 产生的末端都是粘性末端,只有用同一种酶切割产生的相同粘性末端才能通过末端单链的碱基配对并在 DNA 连接酶的作用下进行连接。图 3-14 黏性末端连接法（引自 Snyder&Champness,1977）粘性末端连接法是最常用的 DNA 连接方法,酶切片段基本不需作什么处理就可以用于连接,既经济又省时。由于大多数限制性内切酶都可以产生粘性末端,操作方便。另外,通过粘性末端连接的重组体,其外源片段很容易回收,只要用原来的酶切割重组体就可以了。另外，也可以通过双酶切来获得黏性末端，并可进行定向重组连接（图 3-15）。图 3-15 双酶切进行定向重组连接（引自 Snyder&C

45、hampness,1977）平末端连接(blunt end ligation)是指在 T4 DNA连接酶的作用下(可加入适量的 RNA 连接酶),将两个具有平末端的双链 DNA 分子连接成杂种 DNA 分子。平末端连接的效率比粘性末端连接的效率低得多,所以通常在连接反应体系中要适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂,以提高平末端 DNA 连接的效率。常用的是 PEG8000,加入后,可以起到两个作用:一是可将平末端连接的效率提高1-3 个数量级;二是改变连接产物的分布,抑制分子内的连接,促进分子间的连接,得到的连接产物主要是重组体。选该技术有两个基本的特点分子水平上的操作和细胞水平上的表达基因工程中使

46、用多种工具酶包括限制性内切核酸酶连接酶和其他一些参与合成与修饰的酶类限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶属于水解酶类根据限制性割的方式有平切和交错切作用时需要作辅助因子但不需要和第一个被分离的类酶是连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶有连接酶和连接酶之分基因工程中使用的连接酶来自于原核生物有两种类型的连接酶连接酶进行平末端连接载体是能将分离或合成的基因导入细胞的分子有三种主要类型质粒病毒科斯质粒在这三种类型的基础上根据不同的目的出现了各种类型的改造载体重组连接的方法大致分为四种粘性末端连接平末端连接同聚物接尾连平末端连接的不利之处是连接效率低,需要大量的连接酶,有时为了提高

47、连接效率,通常要补加 RNA 连接酶。连接后,缘由的限制性内切酶内切酶的切点要消失,所以不易回收插入的外源 DNA 片段。3.同聚物加尾法 所谓同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链 DNA 的 3 端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工粘性末端,外源DNA 和载体DNA 分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC),然后在 DNA 连接酶的作用下,连接成为重组的 DNA。这种方法可适用于任何来源的 DNA 片段,但方法较繁,需要 核酸外切酶、S1 核酶、末端转移酶等协同作用（图 3-16）。同聚物接尾法实际上是一种人工

48、粘性末端连接法,具有很多优点:首先不易自身环化,这是因为同一种 DNA 的两端的尾巴是相同的,所以不存在自身环化。因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端,所以连接效率较高。用任何一种方法制备的 DNA 都可以用这种方法进行连接,所以是一种通用的体外重组的方法。图 3-16 同聚物尾连接法(引自 Old&Primrose,1980)1.基因组 DNA 文库 所谓基因组文库(genomic DNA Library),就是用基因工程的方法,人工构建的含有某一生物基因组 DNA 的各种片段的克隆群。一般以改造的噬菌体 DNA 或柯斯质粒作为载体,包括下列过程(图 3-19):高分子量染色体DNA 的

49、制备,体外重组连接,包装蛋白的制备,重组体的体外包装,将重组DNA 导入寄主细胞,筛选。建造基因组文库不仅可以大量扩增含量极少的单拷贝的结构基因,也可以克隆调控基因,有利于研究基因的结构、功能和调控机理。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在行有性生殖的某一群体中,能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中,由于使用的载体不同,分为噬菌体载体和柯斯质粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库。图 3-19 基因组文库技术(引自 Griffiths et 2.cDNA文库 同 mRNA 互补的 DNA 称为 cDNA。mRNA 为模板

50、合成的 cDNA可以用于基因的克隆化,也可用这种方法制备特异性的杂交探针。cDNA文库是以某一生物的总 mRNA 为模板,在无细胞系统中,在反向转录酶的作用下,首先合成一互补的DNA,即第一链,破坏 RMA 模板后,再以第一链为模板合成第二链,得到的双链 DNA 称为 cDNA基因。选用适合的载体,将合成的 cDNA基因重组导入寄主细胞,经筛选得到的 cDNA基因的克隆群称为 cDNA文库(completement DNA Library)(图 3-20)。由于 cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因,因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。图 3-20 cDNA文库构建(引自 Old&Pri