时间分辨荧光免疫分析.docx

《时间分辨荧光免疫分析.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《时间分辨荧光免疫分析.docx（3页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay, TRFIA)是 80 年代 初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。其主要特点是以铜系元素箱(Eu3+) 等标记抗体或抗原为示踪剂，利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除 样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了检测方法的灵敏度和 特异性，还具有量程宽，操作简便，标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多 优点。一、基本原理与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原, 后者用于大分子化合物。镰1系元素错(Eu)、杉(Sm)、钺(Tb)和钛(Nd)

2、通过双功能螯合剂，在水溶液 中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。经抗原、抗体间特异性的免疫结合 反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。锢系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出辆系离子，然后与荧光增 强液中的二酮体生成新的螯合物，经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号, 其增强效力可达100万倍，故又称解离增强锅系荧光免疫分析(dissociation-enhanced-lanthanidefluoroimmunoassay, DELFIA)。辆系元素的发光时间延长，如Eu和Sn?+的荧光衰变时间分别达到4. 3X 105ns和 4. IX 10ns,而样品和试剂中的

3、自然本底荧光的衰变时间仅为410ns,通过延 迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。此外，锢系元素螯合物的激发光波长范 围宽，发射光波长范围窄，stokes位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰, 进一步提高荧光信号的特异性。二、试剂组成(-)E心标记物：可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和 免疫活性。密封后42或-2(rc保存，但应避免反复冻融。若发现蛋白质聚合， 非特异性结合升高，则应停止使用。(二)固相抗体或抗原：固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性 能好，材质均匀，孔间差异小，不同品牌甚至不同批号的微孔条间都会有明显的 性能差异，应引起注意。包被抗原纯度要求高

4、；包被抗体要求效价高，亲和力强。包被后经牛血清白蛋白 封闭，干燥后在4寸、密封、避光、干燥的环境中保存。（三）增强液：试剂纯度不高、器皿清洁度不良或不明原因的污染均可导致增强 液荧光本底升高。因此必须注意试剂的纯度；批号的差异，器皿要用10g/L的 EDTA-Na2溶液浸泡，再用三蒸水洗涤。新配制增强液应用100ml塑料瓶在4C 下保存。（四）校准试剂或标准品：指用生物液或缓冲液配制的一组不同浓度的待测物质 溶液，用于制作计量一反应曲线或用作阴、阳性对照和cutoff值校准。其浓度 已用法定标准物为基准进行标定，标示值与实测值的偏差不得超过10虬 蛋白 质类生物活性物质应进行免疫活性测定，证明

5、其同质性。42或-2CTC保存。（五）质量控制样品：参见放射免疫部分。三、检测步骤以Wal lac公司autoDELFIA全自动时间分辩荧光免疫检测系统测定hTSH为例， 其免疫反应原理为双抗体夹心法，全部试验过程均在autoDELFIA全自动时间分 辩荧光免疫检测系统上按预设程序自动完成，整个检测过程用时约2. 5hr左右。 步骤如下：1 .将100 样品或标准品按顺序加入抗体包被的微孔条中。2 .每孔加入100 U1稀释过的E1+标记抗体工作液。3 .孵育2hro4 .洗涤6次，除去游离Ei?一标记抗体。5 .每孔加增强液200 口1,反应5min。6 .测定荧光强度并经数据处理计算待测物

6、质浓度。四、资料保存及报告要求所有原始记录应妥善保存，以被查考。报告内容包括病人姓名、编号、项目、送检日期、测定日期、测定结果和正常参 考值，推荐使用计算机管理系统对资料进行储存、分类、查询、报告、收费和制 作统计报表。五、质量控制见放射免疫部分。六、注意事项TRIFA法易受内源性和外源性污染，因为在自然环境中锢系离子存在十分广泛， 如空气中的尘埃、烟雾，北方地区尤甚。故需严格控制实验条件，防止污染。（一）器材的清洁度实验所用的一切器材，包括微孔条、加样器、加样头、试剂 瓶必须专用，并经严格洗涤，方法是：2mol/L盐酸浸泡24h,再经0. 1%环化二 乙烯三胺五乙酸（DTPA）浸泡24h,蒸

7、储水冲洗35次，再用高纯度蒸储水 冲洗23次，455CTC干燥后密封储存。（二）蒸僧水的质量蒸储水的纯度直接影响所制的缓冲液、增强液和洗涤液的本 底荧光，通常要求采用三蒸水，最后一次蒸储采用亚沸石英蒸偏器处理。（三）所有实验用试剂必须作本底荧光测定，首先测增强液本底荧光，应 1500cps,其余试剂各取25 R1,加增强液200 R1,振荡15min,放置20min后 测荧光强度，以不高于增强液本底荧光30%为合格。（四）操作者必须严格执行操作规程。不得用手直接接触加样头尖部、微孔条的 孔部，加样完成后应在微孔条上贴上同样大小的胶纸以防尘埃污染，Ed标记物 制备场所应与分析实验场所严格分开，以防大计量EiT污染环境。